分子生物学常用技术(简化版)
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3. 如何检测杂交信号？
同位素标记物： 盖革计数器、液体闪烁计数器 放射自显影(autoradiography)
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如何检测杂交信号？
非放射性标记物： 酶联免疫技术(enzyme linked immuno-assay) 化学发光(chemiluminescence)
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三、如何对核酸探针进行标记？
揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的结构与功能 DNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位 RNA 水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析 蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能 细胞与整体水平：基因在活体中的功能
目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段
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我们需要了解和掌握哪些基本技术？
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1. 探针有哪些种类？
DNA 探针：常规探针 利用基因组 DNA 序列或 cDNA 序列合成的
探针，一般为双链，也可制备成单链 RNA 探针：高灵敏度探针
一般是通过体外转录而来，均为单链 寡核苷酸探针(oligo-nucleotide)：用于点突变检测
人工合成的短序列(~20nt)，可自由选择序列
用途： 确认核酸序列间同源性 对特定核酸序列进行定量 自核酸混合体中辨认特定核酸序列
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一、基本原理
变性(denature) 复性(renature)
杂交 (hybiridization)
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核酸变性
在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程 破坏氢键与疏水作用可导致变性
热变性：高温可使核酸变性，温度高于 90℃时 任何核酸双链都将变性 酸碱变性：pH<3 或 pH>11 时核酸将变性， DNA 使用碱变性，RNA 则不可 化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素 或甲酰胺可使核酸变性
g→mg→μg→ng→pg→fg
常用的放射性同位素
同位素 半衰期 比活性 用途 特点
32P 14.3天 9120
D N A 放 射 性 强
35S 87.1天 1490 D N A /蛋 白
3H 12.1年 29 D N A /蛋 白 分 辨 率 高
125I 60天 2400 蛋 白 标 记 简 单
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影响 DNA 复性速度的因素
DNA 分子的浓度：浓度高，复性快
DNA 分子的长度：长片段复性速度慢
DNA 分子的复杂性：重复序列复性速度快
不同物种C0t曲线比较
人类基因组C0t曲线
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二、核酸探针
Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列 探针为 DNA 或 RNA，可以为单链或双链 探针必需经过标记：放射性标记或非放射性标记
缓冲液清洗 控制温度与变性剂浓度
显色 放射自显影/酶联显色
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五、杂交有哪些不同的方式？
斑点杂交：dot hybridization Southern 印迹杂交：Southern blot Northern 印迹杂交：Northern blot
Western blotting：不是杂交
原位杂交：in situ hybridization
标记方法
标记物
探针
缺口Βιβλιοθήκη Baidu移
同位素或半抗原DNA探针
随机引物标记 同位素或半抗原DNA探针
5’ 或3’ 末端标记 同位素
寡核苷酸探针
PCR标记 体外转录
同位素或半抗原DNA探针 同位素或半抗原单链RNA探针
化学标记
半抗原
均可
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1. 缺口平移
nick translation: 适用于标记双链 DNA 控制 DNase I 的 用量，可以控制 探针的长度
第四篇：分子生物学技术与应用
第19章：分子生物学常用技术－－4学时 分子杂交、PCR、基因测序 蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交) 基因转移与基因剔除(含RNA干扰)
第20章：基因工程－－4学时 第21章：基因诊断与基因治疗－－4学时
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第十九章 分子生物学常用技术
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分子生物学技术能帮助我们干什么？
基本技术： 核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术 蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用
综合技术： 基因工程技术 转基因生物与基因敲除技术
应用技术： 基因诊断 基因治疗
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第一节：核酸分子杂交
Molecular hybridization: 利用已知核酸序列 (探针/probe) 检测与其互补 的未知核酸序列
放射性标记的核苷酸单体
dNTP or NTP 5’ or 3’ P32 labelling
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非放射性标记物
特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及 放射性同位素
地高辛：通过地高辛抗体结合并检测 生物素：结合亲和素/链亲和素 (avidin/streptavidin) 化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光 电子密度标记物：金等重金属
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2. 非放探针的酶促标记
生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可 以参入探针
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3. 非放探针的化学标记
利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合
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四、如何进行杂交？
样品(DNA or RNA)吸附于支持物 尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等
与标记的探针杂交 封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行
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2. 标记物有哪些？
标记物的要求： 高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列 高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检 测到特异的靶序列
标记物的种类： 放射性同位素(radio isotope) 非放射性标记物(non-radioactive label)
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放射性同位素
特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微 量的核酸序列
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变性温度
Tm：melting temperature，解链温度或变性温度 影响变性温度的因素：
溶液的离子强度 变性温度与离子强度 正相关，低盐利于变性
DNA分子的 GC 含量 GC％＝(Tm－69.3)×2.24
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核酸复性
变性的 DNA 单链相互识别并结合，恢复其天然双 螺旋结构的过程 复性类似与化学反应，需要一定反应时间
反 Northern 印迹杂交：reverse Northern blot 基因芯片/DNA微阵列：Genechip/DNA microarray
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dot hybridization
将核酸样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交 特点：简便但特异性不高
3. 如何检测杂交信号？
同位素标记物： 盖革计数器、液体闪烁计数器 放射自显影(autoradiography)
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如何检测杂交信号？
非放射性标记物： 酶联免疫技术(enzyme linked immuno-assay) 化学发光(chemiluminescence)
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三、如何对核酸探针进行标记？
揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的结构与功能 DNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位 RNA 水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析 蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能 细胞与整体水平：基因在活体中的功能
目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段
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我们需要了解和掌握哪些基本技术？
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1. 探针有哪些种类？
DNA 探针：常规探针 利用基因组 DNA 序列或 cDNA 序列合成的
探针，一般为双链，也可制备成单链 RNA 探针：高灵敏度探针
一般是通过体外转录而来，均为单链 寡核苷酸探针(oligo-nucleotide)：用于点突变检测
人工合成的短序列(~20nt)，可自由选择序列
用途： 确认核酸序列间同源性 对特定核酸序列进行定量 自核酸混合体中辨认特定核酸序列
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一、基本原理
变性(denature) 复性(renature)
杂交 (hybiridization)
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核酸变性
在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程 破坏氢键与疏水作用可导致变性
热变性：高温可使核酸变性，温度高于 90℃时 任何核酸双链都将变性 酸碱变性：pH<3 或 pH>11 时核酸将变性， DNA 使用碱变性，RNA 则不可 化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素 或甲酰胺可使核酸变性
g→mg→μg→ng→pg→fg
常用的放射性同位素
同位素 半衰期 比活性 用途 特点
32P 14.3天 9120
D N A 放 射 性 强
35S 87.1天 1490 D N A /蛋 白
3H 12.1年 29 D N A /蛋 白 分 辨 率 高
125I 60天 2400 蛋 白 标 记 简 单
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影响 DNA 复性速度的因素
DNA 分子的浓度：浓度高，复性快
DNA 分子的长度：长片段复性速度慢
DNA 分子的复杂性：重复序列复性速度快
不同物种C0t曲线比较
人类基因组C0t曲线
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二、核酸探针
Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列 探针为 DNA 或 RNA，可以为单链或双链 探针必需经过标记：放射性标记或非放射性标记
缓冲液清洗 控制温度与变性剂浓度
显色 放射自显影/酶联显色
精品课件
五、杂交有哪些不同的方式？
斑点杂交：dot hybridization Southern 印迹杂交：Southern blot Northern 印迹杂交：Northern blot
Western blotting：不是杂交
原位杂交：in situ hybridization
标记方法
标记物
探针
缺口Βιβλιοθήκη Baidu移
同位素或半抗原DNA探针
随机引物标记 同位素或半抗原DNA探针
5’ 或3’ 末端标记 同位素
寡核苷酸探针
PCR标记 体外转录
同位素或半抗原DNA探针 同位素或半抗原单链RNA探针
化学标记
半抗原
均可
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1. 缺口平移
nick translation: 适用于标记双链 DNA 控制 DNase I 的 用量，可以控制 探针的长度
第四篇：分子生物学技术与应用
第19章：分子生物学常用技术－－4学时 分子杂交、PCR、基因测序 蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交) 基因转移与基因剔除(含RNA干扰)
第20章：基因工程－－4学时 第21章：基因诊断与基因治疗－－4学时
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第十九章 分子生物学常用技术
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分子生物学技术能帮助我们干什么？
基本技术： 核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术 蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用
综合技术： 基因工程技术 转基因生物与基因敲除技术
应用技术： 基因诊断 基因治疗
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第一节：核酸分子杂交
Molecular hybridization: 利用已知核酸序列 (探针/probe) 检测与其互补 的未知核酸序列
放射性标记的核苷酸单体
dNTP or NTP 5’ or 3’ P32 labelling
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非放射性标记物
特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及 放射性同位素
地高辛：通过地高辛抗体结合并检测 生物素：结合亲和素/链亲和素 (avidin/streptavidin) 化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光 电子密度标记物：金等重金属
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2. 非放探针的酶促标记
生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可 以参入探针
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3. 非放探针的化学标记
利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合
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四、如何进行杂交？
样品(DNA or RNA)吸附于支持物 尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等
与标记的探针杂交 封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行
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2. 标记物有哪些？
标记物的要求： 高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列 高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检 测到特异的靶序列
标记物的种类： 放射性同位素(radio isotope) 非放射性标记物(non-radioactive label)
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放射性同位素
特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微 量的核酸序列
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变性温度
Tm：melting temperature，解链温度或变性温度 影响变性温度的因素：
溶液的离子强度 变性温度与离子强度 正相关，低盐利于变性
DNA分子的 GC 含量 GC％＝(Tm－69.3)×2.24
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核酸复性
变性的 DNA 单链相互识别并结合，恢复其天然双 螺旋结构的过程 复性类似与化学反应，需要一定反应时间
反 Northern 印迹杂交：reverse Northern blot 基因芯片/DNA微阵列：Genechip/DNA microarray
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dot hybridization
将核酸样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交 特点：简便但特异性不高