仪器分析实验教案-化本11级

实验一 荧光分光光度法测定维生素B2的含量（4学时）一、实验目的 1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。

2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。

二、实验原理1.维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：H HOHOHOHN H H H OHN CN O OH 3C H 3C维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。

维生素B2溶液在430～440 nm 蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm 。

维生素B2在pH=6～7的溶液中荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。

维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

2.荧光分光光度计(1)常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。

在稀溶液中，荧光强度IF 与物质的浓度c 有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度IF 与荧光物质的浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。

bc I I F εφ0303.2=Kc I F =(2)荧光分析法的特点:a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。

b.选择性好。

荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。

c.所需试样量少、操作方法简便。

(3)荧光分析仪器a.常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部b.荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：(a)荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响； (b)荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。

c.荧光分光光度计工作原理：由光源氙弧灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅，固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱，简称荧光光谱。

当测绘荧光激发光谱时，将荧光单色器的光栅固定在最适当的荧光波长处，只让激发光单色口的凸轮转动，将各波长的激发光的强度讯号输出至记录仪，所记录的光谱即激发光谱。

当进行样品溶液的定量分析时，将激发光单色器固定在所选择的激发光波长处，将荧光单色器调节至所选择的荧光波长处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。

三、实验仪器和试剂主要仪器：荧光分光光度计；1cm石英皿；25mL容量瓶；1mL、5mL移液管试剂：维生素B2标准溶液：10.0μg/mL；待测样品溶液四、实验步骤1、系列标准溶液的制备取维生素B2标准溶液(10.0μg/mL) 0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL 分别置于25mL的容量瓶中，各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。

得浓度依次为0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.60μg/mL、0.80μg/mL、1.00μg/mL的一系列维生素B2标准溶液。

待测。

2、标准溶液及样品的荧光测定将激发波长固定在最大激发波长，荧光发射波长固定在最大荧光发射波长处。

测量上述系列标准维生素B2溶液的荧光发射强度。

数据记录于表1中。

以溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。

在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度，计算待测样品溶液中的维生素B2的含量。

五、实验注意事项1.使用荧光分光光度计时，要按照仪器使用规定使用，不可随意操作；2.使用石英比色皿时，要注意勿用手直接触摸比色皿表面，因握住侧棱。

六、实验数据记录及处理1、在EXCEL上拟合系列标准溶液浓度与荧光发射强度的标准曲线图。

2、由校准曲线查出并计算待测样品溶液中的维生素B2的含量。

七、思考题1.试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因?2.维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？实验二火焰原子吸收光谱法测定水中钙含量（4学时）一、实验目的1、了解原子吸收光谱仪的构造及使用方法。

2、了解火焰原子吸收分光光度法分析原理。

3、掌握标准曲线法测定元素含量的分析技术。

二、实验原理原子吸收光谱法是基于气态基态原子外层的电子对共振线的吸收。

气态的基态原子数与物质的含量成正比。

当式样组成复杂，配制的标准溶液与式样组成之间差别较大时，常采用标准法，本实验就使用标准加入法，基本方法是在五个容量瓶中加等量的待测式样，分别加入不等量（倍增）的标准溶液，用适当溶剂稀释至一定体积后，依次测出它们的吸光度。

以加入标样的质量为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线，图中横坐标与标准曲线正常的交点与原点的距离X即为容量瓶所含待测元素的质量，再通过计算求出式样的含量。

三、仪器和试剂1. AA-6300C型原子吸收分光光度计、乙炔钢瓶，空气压缩机、钙空心阴极灯2. 容量瓶：1000mL一个，100mL 7个。

3. 移液管：5mL，10mL各1支。

4. 钙标准溶液：2.0 4.0 6.0 8.0 10.0ug/ml5. 自来水样四、实验步骤1、钙标准溶液的配制A、精确称取1.400g标准品氧化钙，用蒸馏水定容至1000mL，此溶液含钙1.000mg/mL。

（贮备液）B、用吸管吸取10mL 1.000mg/mL钙的贮备液于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液含钙0.1000mg/mL。

C、用10ml吸管分别吸取2、4、6、8、10mL 0.1000mg/ml的钙溶液于5个100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻线，摇匀。

此系列标准溶液分别含钙2.004.00 6.00 8.00 10.00 ug/mL。

2、自来水样的制备用10ml吸管吸取自来水样于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。

3、参照AA-6300C火焰法操作规程完成钙系列标准溶液吸光值的测定。

测量条件：分析线：422.7nm 灯电流: 3mA燃烧器高度: 5mm 狭缝宽度: 0.4mm4、在相同测量条件下完成样品自来水中钙含量的测定。

5、记录测定值，换算成样品浓度。

6、实验室卫生整理，完成实验报告。

五、AA-6300C操作规程(火焰法)1、开机打开电源（稳压器），依次打开计算机电源，自动启动完Windows（DOS）后，再打开仪器电源开关。

2、初始化启动WizAArd系统，选择联机。

系统很快就会进入初始化，初始化成功“OK”（确定）。

每次开机都必须经过初始化才能控制仪器。

3、寻峰3.1 初始化后出现元素灯选择窗口，如需更改元素灯可以根据需要进行选择。

3.2 选择元素灯后，系统将会弹出被调整元素灯参数对话框，根据需要进行相关的参数设置。

设置好参数后，下一步进行相应的元素灯寻峰。

3.3 单击“寻峰”按钮对当前工作波长进行寻峰。

当需要对当前元素的其他特征波长进行寻峰，可在“特征谱线”下拉框中选择相应的波长。

3.4 当需要查看仪器当前能量状态或需要对能量进行调整时，可依次选择主菜单的【应用】/【能量调试】，4、参数设置寻峰结束后，程序进入系统测试状态，选择系统菜单的“仪器”下的“燃烧器参数设置”，对燃气流量、燃烧器高度和位置进行设置。

一般为1200-1800ml/min（燃气流量）。

调整位置使光斑正好切入燃烧器中缝上方6-8mm。

4.1在进入测量之前，对待测样品进行设置。

单击工具按钮即可打开样品设置向导。

4.2对测量参数进行设置。

单击工具按钮即可打开测量参数设置对话框。

选择计算方式为连续、积分时间为1-3秒、滤波系数0.6秒。

5、测量使用火焰法时，在进入测量前,请依次打开空压机电源、乙炔钢瓶阀门，使乙炔分表压力在0.05-0.06Mpa.，并认真检查气路以及水封。

当您确认无误后，可单击工具按钮即可将火焰点燃。

再单击测量键进行测量。

6、关机在关机前必须经过火焰状态下，先关闭乙炔钢瓶阀门，待火焰熄灭后再关闭空压机。

退出AA系统、再关闭主机、最后关闭电源。

六、实验注意事项（1）AA-6300C型原子吸收分光光度计系精密贵重仪器，在未熟悉仪器的性能及操作方法之前，不得随意拨动主机记录器的各个开关和旋钮。

（2）仪器在开机进行测量时必须严格按照操作规程的方法进行。

（3）本实验使用易燃气体乙炔，故在实验室严禁烟火，以免发生事故。

（4）点燃火焰时，必须先开空气，后开乙炔，熄灭火焰时，则应先关乙炔，后关空气，防止回火，爆炸事故的发生。

七、结果处理1、在坐标纸上画出：钙的校准曲线（注意空白值如何处理）。

2、由校准曲线查出并计算未知样品中钙的含量。

八、思考题1、为什么燃助比和燃烧器高度的变化会明显影响钙的测量灵敏度？2、空白溶液的含义是什么？3、为什么原子吸收光谱仪的光源需要调制？。