蛋白质色谱分离方法

蛋白质色谱分离方法

摘要蛋白质是生命有机体的主要成分，在生命体生长发育的各个阶段都起着重要作用。所以分离和检测蛋白质一直是人们研究的热点。依据蛋白质的物理、化学及生物学特性，已有多种分离手段，如：超滤法、SDS-PAGE、亲和层析等，其中，液相色谱分离技术由于具有重复性好、分辨率高等优势在蛋白质分离检测中得到了广泛的应用。

关键词高效液相色谱高效离子交换色谱反相高效液相色谱高效凝胶过滤色谱高效亲和色谱

一、引言

蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质完全的从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。

1、蛋白质纯化的总战略考虑

蛋白质回收要采用简便易行的方法尽可能多地将目标蛋白从细胞培养上清液、细菌破碎液或组织匀浆中提取出来，收率至少达到90%以上。然后进一步作精纯化，这第一步要求去掉大部分杂蛋白，同时要使样品的体积得到充分浓缩，一般要求要浓缩几十到几百倍，粗提液的体积大大缩小，便于下一步精纯化。而且每一步都要做电泳判断纯化效果。

2、蛋白质分离纯化技术的选择

要尽可能多地了解目标蛋白的结构、氨基酸组成、氨基酸序列，以及蛋白质的空间结构所决定的物理、化学、生物化学和物理化学性质等信息，根据不同蛋白质之间的性质差异或者改变条件使之具有差异，利用一种或多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择最佳的蛋白质提纯方法。

二、色谱技术简介

1、色谱分离技术基本概念

色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。当流动相中携带的混合物流经

固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。

2、色谱分离技术的起源

俄国植物学家茨维特（Tswett ）在1903年3月21日华沙举行的“自然科学学会生物学分会会议”上，发表了题为“On a New Categeory of Adsorption Phenomena and Their Appilcation to Biochemical Analysis”的文章，提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。

1907年，茨维特在德国生物学会议上第一次向人们公开展示了采用色谱法提纯的植物色素溶液及其色谱图——显现着彩色环带的柱管。他为了分离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱法（chromatography）①。

3、蛋白质色谱分离技术及其进展

随着现代科技的飞速发展，从天然产物中分离分析蛋白质的手段也不断得到提高，并出现一些新方法，多肽提取分离常用的方法包括化学萃取法（如醇提、丙酮法）、酶解法、沉淀法、超滤法、逆流分溶法、层析法、电泳法等。蛋白质的分离纯化则离不开色谱分离技术，色谱技术包括气相色谱、液相色谱、纸色谱（纸层析）、薄层色谱（薄层层析）等。对于蛋白质来说，蛋白质分离只能用液相色谱。液相色谱是指流动相为液体（也称为淋洗液），而按固定相的不同又可分为液固色谱和液液色谱。高效液相色谱（HPLC）是生物技术中分离纯化的重要方法，在多肽、蛋白质的分离纯化工艺中显示出优异的性能②。RP-HPLC特别适用于质量不大的蛋白质和多肽物质的分离纯化，主要用于分子量低于5000，尤其是1000以下的非极性小分子多肽的分析和纯化，具有十分高的分辨力③。此外，离子色谱作为液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH 值的水溶液为流动相。蛋白质色谱分离介质的选择则要根据蛋白质的等电点、疏水性、分子量等性质选择。

目前,用于蛋白质混合物的高效分离方法主要有二维电泳和高效液相色谱两种方法。其中因分离度高并具有直观图谱而被普遍采用的方法为二维电泳，即2DE方法。2DE与质谱联用技术已经成为蛋白质组学研究中一个较为成熟的技术平台，被广泛应用于蛋白质组学研究的各个方面。但由于该技术所固有的缺陷：(1)在二维凝胶电泳图谱上,并不是每个蛋白点所包含的蛋白量都足以用于鉴定

蛋白；(2)对于低丰度蛋白、疏水性蛋白、极碱性蛋白(pI>10)、一些极大蛋白(相对分子质量>200000)和极小蛋白(相对分子质量<8000)，二维凝胶电泳还不能够将其很好地显示出来，仅仅只有一些可溶的蛋白被用于研究；(3)费时、费力,而且不容易自动化④，因此近几年对该方法进行了一些改进，如对电泳前生物样品进行预浓缩和预分离、分步提取以及对凝胶的染色过程进行优化，但都未有实质性的进展。为了解决这种方法存在的问题，另一种高效分离方法，高效液相色谱方法(HPLC)获得了愈来愈多的应用，特别是各种模式色谱联用组成多维色谱分离技术逐渐被采用，并与质谱联用以克服二维凝胶电泳存在的缺陷。常见的有高效离子交换色谱、反相高效液相色谱、高效凝胶过滤色谱、高效亲和色谱、高效疏水色谱等技术。

三、色谱技术应用实例

色谱法已广泛用于各个领域，如石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境保护以及空间探索，是多组分混合物首选的分离分析方法。以《中国药典》2005版为例，一部收载中药1146个品种，用薄层色谱进行鉴别或含量测定的有1523项，用高效液相色谱进行定量分析的有479种518项，用气相色谱进行检测的有47种。二部收载的有1967个品种，采用高效液相色谱法的品种有848种。现在色谱法已形成一门专门的科学。

1、离子交换色谱法分离蛋白质( High- performance Ion Exchange Chromatography, HPIEC)

高效离子交换色谱（HPIEC）是根据蛋白质分子在一定pH值和离子强度条件下所带电荷的差异进行分离的方法。由于HPIEC是一个吸附性的梯度洗脱过程，所以具有很好的负载力。近年来已成为分离检测蛋白质的重要方法，而选择聚合物离子交换剂作为离子交换色谱填料，具有稳定性好、离子交换容量大、对蛋白质的分离有选择性等特点。但同时，由于离子交换树脂固定床的床层压力会随着分离过程的进程而不断加大，需要重新填充，会造成固定床填充过程操作麻烦，对密封性要求较高。不过，规模化分离纯化蛋白质过程，使用这种方法，还是具有一定优势的。

2、反相高效液相色谱法分离蛋白质( Reverse- Phase High - performance Liquid Chromatography, RP-HPLC)

在各种模式的HPLC中，RP-HPLC应用最为广泛，是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。它与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱）相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基键合硅胶，典型的流动相是甲醇和乙腈。三氟乙酸(TFA) 作为离子对试剂,是反相色谱中最常用的添加剂。蛋白质分子因其疏水性的不同使其在两相中的分配不同而得以分离。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱