实验十二 厌氧性细菌(1稿)

实验十二厌氧性细菌（厌氧培养方法）

厌氧性细菌（Anaerobicbacteria）是一大群必须在无氧或低氧环境中才能生长繁殖的细菌；一般情况下，这类细菌在无氧条件下比在有氧环境中生长好，不能在空气（氧气浓度大于18%）和（或）二氧化碳浓度小于10%以下的固体培养基表面生长。这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢多以无氧发酵的方式进行。它能引起人体不同部位的感染，包括阑尾炎、胆囊炎、中耳炎、口腔感染、心内膜炎、子宫内膜炎、脑脓肿、心肌坏死、骨髓炎、腹膜炎、脓胸、输卵管炎、脓毒性关节炎、肝脓肿、鼻窦炎、肠道手术或创伤后伤口感染、盆腔炎以及菌血症等。（一）无芽胞厌氧菌主要种类及生物学性状

无芽胞厌氧菌共有23个属，与人类疾病相关的主要有10个属。

1.革兰阴性厌氧杆菌有8个属，类杆菌属中的脆弱类杆菌最为重要。形态呈多形性，有荚膜。除类杆菌在培养基上生长迅速外，其余均生长缓慢。

2.革兰阴性厌氧菌有3个属，其中以韦荣菌属最重要。为咽喉部主要厌氧菌，但在临床厌氧菌分离标本中，分离率小于1%，且为混合感染菌之一。其他革兰阴性球菌极少分离到。

3.革兰阳性厌氧菌有5个属，其中有临床意义的是消化链球菌属，主要寄居在阴道。本菌属细菌生长缓慢，培养需5～7天。

4.革兰阳性厌氧杆菌有7个属，其中以下列3个属为主：

（1）丙酸杆菌属：小杆菌，无鞭毛，能在普通培养基上生长，需要2～5天，与人类有关的有3个种，以痤疮丙酸杆菌最为常见。

（2）双歧杆菌：呈多形性，有分枝，无动力，严格厌氧，耐酸。29个种中有10个种与人类有关，其中只有齿双歧杆菌与龋齿和牙周炎有关。其他种极少从临床标本中分离到。

（3）优杆菌属：单一形态或多形态，动力不定，严格厌氧，生化反应活泼，生长缓慢，常需培养7天，最常见的是迟钝优杆菌。

（二）微生物学检查

要从感染灶深部采取标本。最好是切取感染灶组织或活检标本，立即送检医.学教育网搜集整理。

1.直接涂片镜检：将采集的标本直接涂片染色镜检，观察细菌形态、染色及菌量，为进一步培养以及初步诊断提供依据。

2.分离培养与鉴定：分离培养是鉴定无芽胞厌氧菌感染的关键步骤。标本应立即接种相应的培养基，最常用的培养基是以牛心脑浸液为基础的血平板。置37℃厌氧培养2～3天，如无菌生长，继续培养1周。如有菌生长则进一步利用有氧和无氧环境分别传代培养，证实为专性厌氧菌后，再经生化反应进行鉴定。

厌氧菌广泛分布于自然界以及人和动物的体内，具有以下特点：

1、种类繁多，分类方法多。

（1）按照形态厌氧性细菌分为芽胞厌氧菌和无芽胞厌氧菌两大类。芽胞厌氧菌只有一个菌属，即梭状芽胞杆菌属，共有100多个种；无芽胞厌氧菌有40多个菌属，300多个种和亚种。

（2）根据对O₂的耐受程度，可将厌氧菌分为3大类：（1）对氧极端敏感的厌氧菌：代表菌种为月形单胞菌。这类细菌对厌氧条件要求很高，在空气中暴露10min即死亡，临床上很难分离出；（2）中度厌氧菌：代表菌种为脆弱拟杆菌、产气荚膜梭菌等临床分离常见的厌氧菌。它们在空气中暴露60～90min或在脓汁抽出72h后仍然能分离出来；（3）耐氧厌氧菌：代表菌种为溶组织梭菌。这类细菌不能利用氧，在无氧条件下生长好，而在有氧条件下生长不佳。也有按照其对氧的耐受的程度不同，可分为专性厌氧菌和兼性厌氧菌等。专性厌氧菌（Obligate anaerobe），是指在无氧的环境中才能生长繁殖的细菌。此类细菌缺乏完善的呼吸酶系统，只能进行无氧发酵，不但不能利用分子氧，而且游离氧对其还有毒性作用。如破伤风杆菌、肉毒杆菌、产生荚膜杆菌等。只能在没有游离氧存在的环境中生存的微生物。甲烷菌即属此类细菌。人们利用甲烷菌等产生沼气，利用厌氧菌处理各种有机废物和废水。

如梭菌、甲烷菌、硫酸盐还原菌以及大部分光合细菌。

与此相反，无论有氧状态还是无氧状态都能生长发育的细菌，则称它为兼性厌氧细菌（facultative obligate anaerobe）。专性厌氧菌除通过发酵，光合作用获得能量外，有的能把硫酸盐那种的无机氧化物作为末端电子受体而加以利用。据认为，在专性厌氧菌中，通过发酵获得能量的一般都缺少细胞色素或过氧化氢酶，氧对生长，其所以有害，是由于缺少超氧化物不均化酶和过氧化氢酶，而对由黄素系氧化酶的作用而产生的有害的超氧化物或过氧化氢不能分解所致。在土壤中与好氧菌共存时，在有通透空气的地方也可发现有厌氧菌的存在。在兼性厌氧菌中，很多是像大肠杆菌那样，有氧存在时是借助呼吸，氧不存在时是借助发酵来获得能量的。但也有的像乳酸菌那样，即使有氧存在，主要也是借助发酵来获得能量。因而即使是兼性厌氧菌，其中也包括从在有氧条件下生长十分良好的直到无氧条件下生长十分良好的各种各样的情况。

（3）根据革兰氏染色可分为厌氧革兰阳性球菌（消化链球菌）、厌氧革兰阳性杆菌（乳酸杆菌、痤疮丙酸杆菌、放线菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌）、厌氧革兰阴性杆菌（脆弱类杆菌、产黑色素普雷沃菌、具核梭杆菌、坏死梭杆菌）、厌氧革兰阴性球菌（韦荣球菌）。

2、分布广泛。在正常人体的皮肤以及所有与外界相通的腔道如口腔、上呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道等的黏膜上均有大量厌氧菌寄居。除梭状芽胞杆菌能以芽胞的形式在自然界长期存活外，绝大多数厌氧菌存在于人和动物体内，与需氧菌、兼性厌氧菌共同组成人体的正常菌群，并且在种类和数量上占绝对优势，如在结肠中，厌氧菌与需氧菌或兼性厌氧菌的比例为1000:1，即厌氧菌占结肠细菌的99.9%。

3、主要临床及细菌学指征：①感染局部有气体产生；②发生在黏膜附近的感染；③深部外伤；④分泌物恶臭或为暗血红色或出现红色荧光；⑤某些抗生素治疗无效的感染；⑥标本直接镜检见细菌染色不均、呈明显多形态；或镜检查见细菌，而有氧培养无细菌生长。

4、厌氧菌感染的原因：局部组织的氧化还原电势降低，形成有利于厌氧菌生长的厌氧微环境；机体免疫功能下降及屏障作用破坏；菌群失调或厌氧菌的寄居部位发生改变等。

目前，培养厌氧微生物的技术和方法不断改进，日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。目前简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术、厌氧罐培养技术、厌氧袋培养技术、亨盖特（Hungate）厌氧滚管技术等。

一、临床意义

厌氧菌一般为条件致病菌。主要存在于人体及动物体内，特别是肠道、口腔、上呼吸道和泌尿生殖道等处，与需氧菌和兼性厌氧菌共同构成机体的正常菌群。在正常菌群中厌氧菌通常占有绝对的优势。正常情况下，菌群保护相对平衡，如长期应用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等，发生菌群失调，或机体抵抗力减退，则可导致内源性厌氧菌感染，也常与其他细菌混合感染。常作为条件致病菌引起各组织和器官的内源性感染，感染可发生于人体的各个部位，遍及临床各科。在临床厌氧菌感染中，内源性感染多于外源性感染；由无芽胞厌氧菌引起的感染多于芽胞厌氧菌的感染；混合感染多于单纯厌氧菌感染。

破伤风梭菌广泛存在于土壤、人与动物的肠道中，芽胞在土壤中可存活数年，经伤口感染，在厌氧条件下生长繁殖，引起破伤风。产气荚膜梭菌是气性坏疽的主要病原菌，某些型别也可引起食物中毒和坏死性肠炎。也常与兼性厌氧菌混合感染，引起深部脓肿，腹腔、盆腔、胸腔感染、败血症、心内膜炎以及胆道、泌尿道、女性生殖道感染等。肉毒梭菌在厌氧环境中，可分泌毒性极强烈的肉毒毒素，被食入可引起特殊的神经中毒症状，病死率极高。婴幼儿若食入被肉毒梭菌芽胞污染的食物，引起婴幼儿肉毒病。艰难梭菌是人类肠道正常菌群，可因菌群失调而引起伪膜性肠炎，是医院内感染的病原菌之一。此外，艰难梭菌尚能引起气性坏疽、肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔和阴道感染及菌血症等。

无芽胞厌氧菌是一大类寄生于人体的正常菌群，引起的感染均为内源性感染，在一定的致病条件下，可引起多种人类感染。所致疾病有：

1.败血症：主要由脆弱类杆菌引起，其次为革兰阳性厌氧球菌医.学教育网搜集整理。

2.中枢神经系统感染：主要由革兰阴性厌氧杆菌引起，常可引起脑脓肿。

3.口腔与牙齿感染：主要由消化链球菌、产黑素类杆菌等引起。

4.呼吸道感染：主要由普雷沃菌属、坏死梭杆菌、核梭杆菌、消化链球菌和脆弱类