膜片钳技术及其发展概论
膜片钳技术及其发展概论
（9:00 开始） 下午 （14:00 开始） 8月2日 上午 （9:00 开始）
QPatch 全自动膜片钳介绍
（全自动膜片钳技术概述、QPatch 功能特点介绍 ）
动物呼吸机及麻醉机的选择和应用 脂质双分子层的实验方法
Tracy Price 博士 Ed Buck 博士
ANY-MAZE 视屏软件在动物行为实验中的应用 EPC 系列膜片钳放大器的使用
一、膜片钳技术的原理
离子通道简介
离子通道是镶嵌在动、植物细胞膜上的一类特殊蛋白质， 它们负责转运细胞膜内外的各种离子，参与各种细胞功 能，主Fra bibliotek包括：
维持细胞静息膜电位，产生动作电位，从而调节细胞的 兴奋性、不应性和传导性； 调节细胞内Ca2+、cAMP、cGMP等第二信使 的浓度， 触发肌肉收缩、腺体分泌、基因表达等一系列细胞生理 反应； 参与神经元的突触传递； 维持细胞的正常体积。
三、膜片钳技术的发展概况
膜片钳记录技术自创立以来，经历了许多发展变化 简单介绍如下：
（1）记录方式有很大变化 除了传统的单通道记录方式以及普通全细胞记录方式外， 又陆续发展了膜穿孔记录方式（Perforated patch clamp）、巨 膜片记录方式（Giant membrane patch）、松散封接记录方式 （Loose patch clamp）等等。
1983年 10月 ， Sakmann 和 Neher主 编 的 《Single-Channel Recording》一书问世，对当时的膜片钳技术进行了全面、 系统的总结，从此奠定了膜片钳技术的里程碑。 1995年，《Single-Channel Recording》一书再版，增添了 大量膜片钳技术的新内容，几乎当时国际上所有的知名膜 片钳专家都参与了编写，成为目前膜片钳技术研究领域的 最经典著作。
膜片钳技术的发展及其应用
第27卷 第2期 运城学院学报V o.l27 N o.2 2009年4月 Journa l of Y uncheng U n i versity Apr.2009膜片钳技术的发展及其应用曹建斌(运城学院生命科学系,山西运城044000)摘 要:膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的,来反映细胞膜上离子通道活动的一项技术。
它对通过离子通道的离子电流进行记录,目前已发展出多种记录模式,广泛应用于神经科学、药理学、细胞生物学、生理学和分子生物学等学科领域。
概括了膜片钳技术的基本原理,归纳出该技术的主要操作步骤,并对其发展与应用进行了总结。
关键词:膜片钳;离子通道;电生理;发展及应用中图分类号:Q424 文献标识码:A 文章编号:1008-8008(2009)02-0053-03细胞是构成生物体的基本单位。
在细胞的外周有一层以脂类和蛋白质分子为主要成分的细胞膜,在细胞膜上存在有多种离子通道,细胞通过这些通道与外界进行物质、能量和信息的交流。
离子通道是细胞兴奋性的基础,在细胞内及细胞与细胞之间的信号传递中起着非常重要的作用。
对离子通道的研究来源于生理学实验,英国学者H uxley和K atz[1]最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化,但由于该技术对细胞的损伤大,难以使细胞膜各处的生理特性保持一致,因而逐渐被膜片钳技术所取代。
膜片钳技术为生物膜离子通道的门控动力学研究和不同离子通道的通透性以及细胞的生理特性研究提供了直接的手段。
1.膜片钳技术的基本原理膜片钳技术(patch-cla m p techni que)是在电压钳技术的基础上发展起来的,采用记录流过离子通道的离子电流,来反映细胞膜上单一的(或多个的)离子通道分子活动的技术。
该技术可将一尖端经加热抛光的玻璃微电极管吸附只有几平方微米的细胞膜,在玻璃电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接,因而可通过微电极直接对膜片(细胞膜小区域)进行电压钳制,而无需使用其它微电极(如图1)。
膜片钳的发展与应用
膜片钳技术的发展与应用崔梦梦（生命科学学院 1241410026）摘要：膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的，该技术的核心是能够记录单一离子通道的电流。
膜片钳可以测量到0.06pA的电流，它具有1um的空间分辨率和10us的时间分辨率。
作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离子通道的“金标准”。
应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机稍等进行深入的研究。
此外，将膜片钳技术与其他一些先进的技术结合，使其在药理学、病理学、神经科学、脑科学、细胞生物学和分子生物学等生物科学方面,，得到了越来越广泛的应用。
关键词：膜片钳；离子通道；发展与应用在细胞膜上存在有许多的离子通道，这些离子通道是细胞兴奋性的基础，对细胞内以及细胞之间的信息传递起着非常重要的作用。
为探究离子通道的功能和结构，许多电生理技术被发明创造。
英国学者Huxley和Katz最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化，但由于该技术钳制的细胞膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的离子通道，因而不能测定单一离子通道电流。
所以在1976年德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann 建立起一种新的技术，即膜片钳技术，并且逐渐取代了电压钳技术。
随着膜片钳技术的不断完善，自1981年以来, 该技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果。
膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
一、膜片钳技术的基本原理膜片钳技术是利用玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含1—3个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已于膜的其他部分相互分隔。
电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。
膜片钳技术概述
膜片钳技术概述12膜片钳记录基本步骤目录概述3 常用检测基本原理 4膜片钳技术应用PART 1概述研究离子通道生化确定蛋白质氨基酸序列+X 线衍射确定结构+…… 电生理技术（膜片钳+动态钳……)电生理技术+转基因技术+…… 1、结构 2、功能3、结构和功能/WOS_GeneralSearch_input. do?product=WOS&search_mode=GeneralSearch&SID=7A2Mq OMDSKr2rKYrDnH&preferencesSaved=•蒸汽机的出现推动了英国的工业革命•膜片钳技术打开了细胞电生理研究的大门离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某些离子（K+/Na+/Ca2+）能选择通透，其功能是细胞生物电活动的基础。
特性：通透性（permeation）选择性（selectivity）门控性（gating）配体门控通道阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体阴离子通道：甘氨酸/GABA 受体膜片钳技术的发展历程•1963年，霍奇金和赫胥黎发现了电压钳技术，并获得了诺贝尔生理或医学奖膜片钳技术打开了细胞电生理研究的大门•1976年，德国马克斯普朗克生物物理化学研究所Erwin Neher和Bert Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到Ach激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。
•1981年，德国马克斯普朗克生物物理化学研究所Owen Hamill和Erwin Neher等对膜片钳技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1 pA 的电流灵敏度、1 μm的空间分辨率和10 μs的时间分辨率。
•1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
•1991年，德国马克斯普朗克生物物理化学研究所Erwin Neher和Bert Sakmann也因其杰出的工作和突出贡献，荣获诺贝尔医学和生理学奖。
patch clamp膜片钳技术的原理和应用(超全的哦)
第二部分
一：应用学科
膜片钳技术的应用
膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规 方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且直 接或间接为临床医学研究服务， 目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科 学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物 细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。 随着全自动膜片钳技术（Automatic patch clamp technology）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高 通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命 力。
5.对药物作用机制的研 在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位（膜内 或膜外）施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可 能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物 生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的 领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理 的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法 观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大 脑皮层神经元L-型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺 血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通 道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型 钙通道有阻滞作用。
膜片钳技术概述
2）屏蔽罩：用铜丝网制成，防止周围环境 的杂散点场对膜片钳放大器的探头电路的干扰。 有的膜片钳实验所测试的细胞或某种物质是光 敏感的，或者膜片钳实验是与光学测量联合进 行测需要采取光屏蔽，则屏蔽罩的外壁用黑色 布遮盖或在暗室里操作以减少强光的干扰。
2、光学部分
倒置显微镜 优点： 具有较好的视觉效果 便于将玻璃微电极与细胞的顶部接处。 具有较好的机械稳定性。
荧光染料Fu ra-2 可被紫外光激发发射出 荧光, 它可选择性地结合钙离子, 而与钙离子 结合的Fu ra-2 越多, 以相同紫外光激发出的 荧光就越弱, 因此可根据荧光强度的变化计算 出单位体积中钙离子浓度的变化。具体过程为: 在做全细胞记录之前, 以孵育或经电极扩散的 方法使荧光染料Fu ra-2 进入细胞, 然后对该 细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞 膜电容等多种指标变化情况进行观测,并分析 这些变化间的相互关系。
电极电容Cp极小，只有几各pF，相应的 电路时间常数甚小，因而对于Cp瞬态补偿称为 快电容补偿，细胞膜电容的值约为1µF／cm2， 由于此时的充电电流需要流经串联电阻Rs（Rs 的值约为几个兆欧），时间常数较大，故Cm 的补偿称为慢电容补偿。此外，串联电阻Rs因 跨接在Cp和Cm之间，当有电流经过时，将产 生可观的压降，如当Rs＝5MΩ ，I＝2mA时， 可导致钳制电位误差达10mV；消除这种误差的
3、电子部件：包括膜片钳放大器、刺激器、示
波器及记录系统。 膜片钳放大器：
是膜片钳实验中一个核心仪器，通过它 把生物电信号放大。从原理来说，膜片钳放大 器的探头电路即I-V变换器有两种基本结构形 式，即电阻反馈式和电容反馈式，前者是一种 典型的结构，但是相比较而言，后者降低了噪 声，所以特别适用超低噪声的单通道记录。
膜片钳技术及其应用
膜片钳技术可以用于研究细胞信号转导过程中离子通道和受体的变 化，了解信号转导的机制。
细胞功能调控的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞功能调控的机制，例如细胞兴奋性的 调节和细胞内离子浓度的变化。
04 膜片钳技术的优势与局限 性
膜片钳技术的优势
高灵敏度
细胞无损
膜片钳技术具有高灵敏度，能够检测单 个离子通道的活动，从而提供关于细胞 膜电位和离子通道功能的重要信息。
膜片钳技术可以在保持细胞完整性的 情况下进行实验，不会对细胞造成严 重损伤或干扰细胞的正常功能。
实时监测
膜片钳技术可以对细胞膜电位进行实时 监测，从而了解离子通道的动态变化， 有助于深入理解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术的局限性
1 2 3
实验条件要求高
膜片钳技术需要高精度的实验设备和条件，包括 低温、低噪声和低阻抗等，这增加了实验的难度 和成本。
03
04
05
膜片钳放大器
微操纵器
细胞培养皿或显 微镜载玻片
电极溶液
细胞内和细胞外 灌流液
用于放大细胞膜电信号， 提高信号的检测灵敏度。
用于精确控制电极的移动 ，以便在细胞膜上定位和 进行膜片钳实验。
用于培养和固定细胞，以 便进行膜片钳实验。
用于填充电极，以保持电 极的湿润和导电性。
用于维持细胞内外环境的 稳定，并排除干扰实验的 物质。
03
在单细胞水平上研究细胞信号转导和离子通道功能，深入了 解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术与其他技术的联合应用
结合光学成像技术，利用膜片钳技术对神经元电生理特性进行同时监测和成像，实现多参数的同时测 量。
与基因编辑技术结合，利用膜片钳技术对特定基因表达的离子通道进行功能研究，深入了解基因与离子 通道的关系。
第十五膜片钳技术简介
Singlechannel recording
Macrocurrent recording
Macrocurrent recording
Advantages
Major Disadvantage
Physiological conditions
Easy to obtain
Extracellular superfusion No washout
Missing essential internal substance
Disrupt cytoplasmic contents
Not easy to obtain
OUTLINE
1、电生理学简介
2、膜片钳技术概述 3、膜片钳技术应用
Unknown membrane potential; No superfusion
Cytosolic superfusion Extracellular control Not easy to obtain
Extracellular superfusion Cytosolic control
Extracellular superfusion Cytosolic control
DAD-VC system
MicroManipulators
CCD Camera
Electrophysiology-Apparatus
Electrophysiology-Apparatus
Patch clamp
Patch clamp-application
取材形式 脑片(slices)
单细胞
Patch clamp
Erwin Neher
膜片钳技术原理
膜片钳技术原理膜片钳技术是一种常见的实验技术，广泛应用于生物学、药理学、细胞生物学等领域。
它是利用一种特殊的仪器，通过对细胞膜的控制和操作，实现对细胞内外环境的调控和研究。
膜片钳技术的原理主要涉及到膜片形成、膜片钳的构造和工作原理等方面，下面将对这些内容进行详细介绍。
首先，膜片的形成是膜片钳技术的基础。
膜片是由玻璃或石英毛细管制成的，其内外涂有一层导电性金属。
在形成膜片的过程中，需要将毛细管和细胞膜接触，利用毛细管的吸附作用将细胞膜抽附到毛细管上，形成一个微小的膜片。
这一步骤的关键是要保持膜片的完整性和稳定性，以确保后续实验的准确性和可靠性。
其次，膜片钳的构造是实现膜片钳技术的重要工具。
膜片钳通常由微操作系统、压力控制系统、电压控制系统等组成。
微操作系统用于控制膜片的形成和定位，压力控制系统用于控制膜片与细胞膜的接触压力，电压控制系统用于记录和调节膜片与细胞膜之间的电压变化。
这些系统的协同工作，使得膜片钳能够对细胞膜进行高度精准的操作和控制。
最后，膜片钳技术的工作原理是通过对膜片与细胞膜之间的接触和电学特性的测量，实现对细胞内外环境的调控和研究。
在实验中，可以通过改变膜片与细胞膜的接触压力和电压，观察细胞膜的电学特性和通透性的变化，从而研究细胞的离子通道、受体通道等功能。
同时，也可以利用膜片钳技术对细胞内外环境的离子浓度、pH值等进行精准调控，以研究细胞的生理和病理过程。
总之，膜片钳技术是一种重要的细胞生物学实验技术，其原理涉及膜片的形成、膜片钳的构造和工作原理等方面。
通过对这些原理的深入理解和掌握，可以更好地应用膜片钳技术进行细胞内外环境的调控和研究，为生物学、药理学等领域的研究工作提供重要的技术支持。
膜片钳技术
测试题：
1. 膜片钳的主要记录方式有哪几种，各
有何优缺点? 2. 什么叫整流，产生整流的原因是什么？
膜的被动反应
离子通道开放 膜的主动反应
外向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向Y轴（电流轴）靠 近。如IK电流。
内向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向X轴（电压轴）靠 近。如烟碱电流。
去极化方向
去极化方向
IK电流的外向整流
烟碱电流的内向整流
尾电流（Tail current）
指通道在激活因素结束时的关闭过程中，所记录
6. 基本概念及参数设置
输入漏电流（Input leakage current）
理论上讲，不施加外部命令时，通过放大 器探头的电流应该为0，如果由于放大器本 身的原因产生了电流，这就是漏电流。由于 放大器控制电流漂移的质量很高，一般漏电 流都很小。
封接电流（Seal current）
由于封接质量不高（没有形成良好的高 阻封接），从封接处产生的电流。成为噪 声。
第三部分
全细胞记录结果举例
+80mV
+40mV
0mV
-40mV
-80mV 200ms
Iso Hypo
Current Density (pA/pF)
-40
60
30
0 -80 0 -30 40 80
Voltage (mV)
-60
Iso 4 Iso 2 Hypo Hypo
Current (nA)
0
倒 置 相 差 显 微 镜
EPC-7膜片钳放大器(德国)
4. 膜片钳的记录方式及基本操作
细胞吸附式（Cell-attached
药物心脏毒性研究技术之膜片钳技术
药物⼼脏毒性研究技术之膜⽚钳技术⼀些药物在使⽤的过程中引发的⼼脏毒性是威胁患者⽣命的毒副作⽤之⼀，如抗⼼律失常药物导致的⼼脏不良事件时有报道，虽然这种事件发⽣率低，但是危险性⼤，主要表现为⼼电图QT间隔延长，严重可以引起尖端扭转型室性⼼动过速。
因此在新药上市前，需要进⾏药物安全性评价时，尽早发现药物的潜在⼼脏毒性，以减少新药研发的投⼊和风险。
被称为研究离⼦通道的“⾦标准”的膜⽚钳技术，是药物早期⼼脏毒性评价的主要技术之⼀。
QT间期是指⼼室除极和复极的全过程，即QRS波群的起点到T波终点的时程。
QTc间期是指排除了⼼率影响的校正的QT间期。
⼼脏复极延迟，将导致发⽣⼼律失常的风险明显增⾼，最常见的是引发尖端扭转型室性⼼动过速(TdP)， TdP易演变成⼼室纤颤并导致猝死，因此QT间期延长，被认为是预测引发TdP的⽣物标记物。
在新药开发过程中，进⾏药物安全性评价的⼼脏毒性评价时，应确认研究药物对QT间期的影响，防⽌其上市后引起恶性⼼律失常。
hERG通道产⽣的电流是⼼室复极中最重要的电流，通道被药物后抑制直接导致Long QT综合症，很可能演变成尖端扭转型室性⼼动过速，⼼室纤颤，直⾄猝死。
长QT综合症(LQTS)是⼀种异常的⼼肌细胞复极化电活动，获得性的LQTS常常是药物治疗的结果。
研究发现许多常⽤药物包括抗⼼律失常药、抗精神病药物、抗菌素以及可卡因均可引起获得性的LQTS。
⽬前发现⼏乎所有的临床药物所导致的LQT 或者TdP 都作⽤于hERG。
由于导致hERG抑制的药物在化学结构上没有明显的共性，从⽽很难预测，仅有通过实验的⽅式给予解决。
全⾃动膜⽚钳技术⼀个重要的应⽤⽅向是检测早期药物化合物对hERG的毒副作⽤。
美迪西引进HEKA膜⽚钳系统（Patch Clamp System），该系统为放⼤器与数模转换器⼀体，可通过软件与⼿动操作相结合，达到⽐全⾃动更精准的程度，将会⼤⼤增强美迪西体外药物安全性评价服务。
膜片钳实验与技术
汇报人：
通过施加电压或 药物刺激可以观 察到离子通道的 开放或关闭状态 从而了解离子通 道的电学特性和 药理学特性。
膜片钳实验原理的 应用广泛可用于研 究药物对特定离子 通道的作用机制和 效果以及研究细胞 生理和病理过程中 的离子通道变化。
准备实验器材：包括膜片钳放大器、微电极、细胞、溶液等
制作细胞膜片：使用微操纵器将微电极置于细胞膜表面形成封 接
膜片钳技术的未 来发展方向
神经科学：研究神经元电活动与行为之间的关系 药理学：筛选和验证药物作用靶点及效果 生理学：研究细胞生理功能及信号转导机制 病理学：探究疾病发生发展过程中细胞电生理变化
PRT THREE
膜片钳技术是通 过玻璃微电极记 录细胞膜单一离 子通道活动的技 术。
膜片钳实验原理 基于膜片钳夹持 技术能够将细胞 膜的某一离子通 道单独夹持在玻 璃微电极之间。
膜片钳技术将进一 步应用于研究神经 元功能和药物作用 机制
膜片钳技术有望在 基因治疗和细胞疗 法等领域发挥重要 作用
膜片钳技术将与新 型技术相结合提高 实验效率和精确度
膜片钳技术将为研 究生物电信号和离 子通道提供更深入 的见解
挑战：高精度的测量和控制技术 挑战：细胞类型特异性标记和分离技术 展望：结合新技术实现更高效和准确的膜片钳实验 展望：拓展膜片钳技术在生物医学领域的应用范围
膜片钳技术用于筛 选潜在药物候选物
膜片钳技术用于研 究药物对神经元信 号转导的影响
膜片钳技术用于研 究药物对心血管系动化与智能化：提高实验效率和准确度 新型材料的应用：提高膜片钳技术的稳定性和可靠性 跨学科融合：与其他领域的技术相结合拓展应用范围 标准化与规范化：推动膜片钳技术的普及和推广
PRT FIVE
膜片钳
膜片钳技术及其应用21世纪被称为生物学世纪，近数十年来，生命科学与生物技术取得了迅猛发展。
任何一项新的生物技术的诞生，均意味着生命科学的某个或某些领域将获得新的生命，其内容和内涵将得到扩大和延伸。
膜片钳技术的创建也为生命科学的研究带来了一场革命性的变化。
简介细胞是动物和人体的基本组成单元。
细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系。
细胞间与细胞内的通信，主要依靠其膜上的离子通道来进行。
离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦即产生生物电现象的基础。
生物电信号通常是用电学或电子学方法进行测量，由此形成一门用以揭示细胞生理过程的细胞电生理学。
早期的研究多使用双电极电压钳技术作胞内记录，自40年代末细胞膜和离子学说建立以来，细胞电活动的研究逐渐深入。
在1976～1981年期间，两位德国细胞生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann所开创的膜片钳技术（patch clamp technique）为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，膜片钳实验技术是对细胞和分子水平的生理学研究方法的一次革命，因而两位科学家于1991年荣获诺贝尔生理学或医学奖。
膜片钳实验技术为生理学、神经科学、细胞生物学等生命科学专业的研究和发展带来了新的生命。
膜片钳技术的发展历史膜片钳技术的发展历史也是一个科学的发展历程，回顾此过程或许对我们现在的研究和对问题的看法有所启示。
膜片钳技术的创立是建立在前人发明的电压钳(V oltage-clamp)和电流钳（Current-clamp）以及玻璃微电极(Glass micro-pipettee)的基础之上。
电压钳首先是由George Marmont和美国学者Kenneth S. Cole等提出，随后英国学者Alan L. Hodgkin、Andrew F. Huxley和Bernard Katz等最先应用的。
早在19世纪末20世纪初，Julius Bernstein就神经的电脉冲提出了“细胞膜假说”（membrane hypothesis）（1902和1912年），推测神经细胞的静息电位（resting potential）是由细胞膜对K＋离子的选择性通透所形成，而神经元的兴奋（即动作电位，action potential）是由于细胞膜对K＋离子的选择性通透性丧失所造成。
膜片钳技术原理及相关基本知识
膜片钳技术可以用于研究内分泌系统的电生理特性，了解激素分泌的 调节机制。
其他领域的应用
肿瘤学研究
膜片钳技术可以用于研究肿瘤细胞的 电生理特性，了解肿瘤的发生和发展 机制。
免疫学研究
膜片钳技术可以用于研究免疫细胞的 电生理特性，了解免疫反应的调节机 制。
THANKS
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膜片钳技术可以用于药物筛选， 快速筛选出具有潜在治疗作用的 药物。
膜片钳技术可以用于研究药物对 离子通道的影响，了解药物的副 作用和不良反应。
生理学领域的应用
心血管系统研究
膜片钳技术可以用于研究心血管系统的电生理特性，了解心脏和血 管的电活动和功能。
呼吸系统研究
膜片钳技术可以用于研究呼吸系统的电生理特性，了解呼吸肌的电 活动和功能。
膜片钳技术的应用领域
生理学研究
研究细胞膜离子通道的电生理 特征和功能，揭示生理状态下
细胞膜电活动的规律。
药理学研究
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，为新药研发提供实 验依据。
神经科学研究
研究神经元和神经网络的电活 动和信息传递机制，揭示神经 系统的工作原理。
疾病机制研究
研究疾病状态下细胞膜离子通 道的异常变化，为疾病诊断和
数据采集
使用膜片钳系统记录细胞膜 电位变化，通过放大器和记 录器获取数据。
数据筛选
排除异常或噪声数据，确保 数据质量。
数据转换
将原始数据转换为适合分析 的格式，如电压值或电流值 。
数据分析方法
统计分析
对数据进行统计分析，如平均值、标准差、相 关性等。
频谱分析
对数据进行频谱分析，以了解信号的频率成分。
膜片钳技术适用于多种细胞 类型，包括神经元、肌肉细 胞、上皮细胞等，具有广泛 的应用范围。
膜片钳技术
膜片钳技术膜片钳技术80年代初发展起来的膜片钳技术(patch clamp technique)为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段。
该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其他生命现象更进一步的了解，而且对于疾病和药物作用的认识也不断的更新，同时还形成了许多病因学与药理学方面的新观点。
本文拟对膜片钳的基本原理及在心血管研究中的应用作一综述。
1膜片钳技术基本原理与特点膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴，两者的区别关键在于：①膜电位固定的方法不同；②电位固定的细胞膜面积不同，进而所研究的离子通道数目不同。
电压钳技术主要是通过保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流情况。
因此只能用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道活动。
目前电压钳主要用于巨大细胞的全性能电流的研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥着其他技术不能替代的作用。
该技术的主要缺陷是必须在细胞内插入两个电极，对细胞损伤很大，在小细胞如中枢神经元，就难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致。
膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。
膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。
由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零，形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。
此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。
又由于玻璃微电极尖端管径很小，其下膜面积仅约1 μm2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略，也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略，那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定。
膜片钳技术及应用
膜片钳技术的应用领域
神经科学
研究神经元离子通道与动作电 位的产生和传播，以及药物对
神经元功能影响。
心血管
研究心脏离子通道与心律失常 的关系，以及抗心律失常药物 的作用机制。
药理学
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，以及新药的开发和 筛选。
其他领域
膜片钳技术还可应用于内分泌 、免疫等领域，研究相关细胞
利用膜片钳技术，可以研究神经元在长期和短期内的电生理变化，了 解学习、记忆等认知过程的神经机制。
药物筛选与开发中的应用
药物作用机制的研究
膜片钳技术可以用于研究药物对离子通道或受体电流的影响，从 而揭示药物的作用机制。
药物筛选
通过膜片钳技术，可以在细胞或组织水平上快速筛选出具有特定 药理作用的药物候选物。
物或其他因素对细胞膜功能的影响。
03 膜片钳技术的应用实例
神经科学研究中的应用
神经元电活动的记录
膜片钳技术可以用来记录单个神经元在静息状态和刺激下的膜电位 变化，从而研究神经元的兴奋性和电生理特性。
突触传递的研究
通过膜片钳技术，可以记录突触后电位，研究神经递质释放、受体 激活和信号转导等过程。
神经可塑性的研究
在医学诊断与治疗中的应用
疾病诊断
膜片钳技术可用于检测细胞膜离子通道的异常变化，从而对某些 疾病进行早期诊断，如癌症、神经退行性疾病等。
药物研发
通过膜片钳技术可以研究药物对离子通道的作用机制，为新药研发 提供有力支持。
个体化治疗
根据患者的离子通道基因变异情况，膜片钳技术可以为个体化治疗 提供精准的用药建议。
高通量与高灵敏度
通过改进膜片钳技术的设计和材料，有望实现高通量和高灵敏度的检测， 从而能够同时记录多个细胞或同一细胞的不同活动，提高实验的效率和 精度。
膜片钳技术的发展及应用
膜片钳技术的发展及应用作者：生命科学学院2010级加孜依拉.巴旦1241410034摘要膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的,来反映细胞膜上离子通道活动的一项技术。
它对通过离子通道的离子电流进行记录，目前已发展出多种记录模式,广泛应用于神经科学、药理学、细胞生物学，生理学和分子生物学等学科领域。
概括了膜片钳技术的基本原理, 归纳出该技术的主要操作步骤，并对其发展与应用进行了总结。
关键词膜片钳离子通道电生理发展及应用一、膜片钳技术的发展史1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。
1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。
二、膜片钳技术的基本原理膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”是研究离子通道的最重要的技术。
目前膜片钳技术已从膜片常规钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到自动化膜片钳技（Automated patch clamp technique）。
传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞，对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。
膜片钳技术的发展及应用
膜片钳技术的发展及应用生命科学学院2010级李积锋1241410007【摘要】膜片钳技术是一种广泛应用于生命科学研究的先进电生理技术，为解决生物信息的跨膜信号传导为题提供了先进的研究手段。
膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的,来反映细胞膜上离子通道活动的一项技术。
它对通过离子通道的离子电流进行记录,目前已发展出多种记录模式,广泛应用于神经科学、药理学、细胞生物学、生理学和分子生物学等学科领域。
概括了膜片钳技术的基本原理,归纳出该技术的主要操作步骤,并对其发展与应用进行了总结。
【关键词】膜片钳离子通道电生理1976年[1]德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术。
这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。
它和基因克隆技术并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。
细胞是动植物和人体的基本组成单元，离子通道是细胞与外界以及与细胞内通信的重要手段。
离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础。
生物电信号通常用电学方法进行测量，因而形成了一门学科—细胞电生理学。
最近50年，三次主要的技术革命推动了细胞电生理学的进展：细胞内记录，电压钳技术和膜片钳技术。
一．膜片钳技术发展历史1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接，大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs 的时间分辨率。
膜片钳技术
配体门控性离子通道（ligand-gated ion channel）
电压门控性离子通道（voltage-gated ion channel）
离子通道开关要经过三种以上状态转换：
（二）两个重要的方程：
HUST
Ohm’s law：
I=gE or E=IR or I=E/R
Nernst equation：
HUST
Cell-attached configuration
电极仅与细胞膜很小部分形成Giga-seal,不 损害细胞膜的完整性;
用于单通道记录（single-channel recording) 某一特定的离子通道 细胞不同部位的电流
内面向外式：
HUST
Inside-out configuration
Vh=-80mv Vt=-40mv Unitary
current=2.2pA
2. K+通道电流记录：全细胞记录HUST
K+通道电流记录：单通道记录HUST
Cell-attached
1 pA
Inside-out
0
50
100
150 0
50
100
150
Time (ms)
Time (ms)
3. Ca2+通道电流记录：全细胞记录HUST
电压门控（依赖性）离子通道
3. 膜片钳技术 HUST
Patch-clamp techniques
1980年前后，Neher and Sakmann实验室发明 膜片钳技术，引发电生理 技术一次革命性的突破:
封接阻抗: Giga-seal GΩ级 （109 Ω)
记录电流：pA级（10-12A)
Neher and Sakmann 获1991年诺贝尔生理学或医
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长时程增强（LTP）记录技术
（实验方法、数据分析）
刘振伟 博士
膜片钳技术实验问题答疑 膜片钳实验观摩
刘振伟 博士 刘 斌 博士
膜片钳技术及其发展概述
东乐科技有限公司
2010.8.1 南昌大学
主要内容
一、膜片钳技术的原理 二、膜片钳技术的发展历史
三、膜片钳技术的发展概况
四、膜片钳技术的仪器构成
一、膜片钳技术的原理
离子通道简介
离子通道是镶嵌在动、植物细胞膜上的一类特殊蛋白质， 它们负责转运细胞膜内外的各种离子，参与各种细胞功 能，主要包括：
维持细胞静息膜电位，产生动作电位，从而调节细胞的 兴奋性、不应性和传导性； 调节细胞内Ca2+、cAMP、cGMP等第二信使 的浓度， 触发肌肉收缩、腺体分泌、基因表达等一系列细胞生理 反应； 参与神经元的突触传递； 维持细胞的正常体积。
缓缓提起电极
在低 C中
全细胞记录模式 （Whole-cell recording）
外面向外记录模式 （Outside-out recording）
内面向外记录模式 （Inside-out recording）
膜 片 钳 技 术 的 基 本 记 录 模 式
（7）全自动膜片钳技术的崛起 传统膜片钳技术的局限 ☆每次只能记录一个细胞，是一项耗时耗力的工作 ☆不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选 ☆不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。 全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题， 它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且记 录质量均已、稳定，此外从找细胞、形成封接、破膜等整 个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。 这些优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！
三、膜片钳技术的发展概况
膜片钳记录技术自创立以来，经历了许多发展变化 简单介绍如下：
（1）记录方式有很大变化 除了传统的单通道记录方式以及普通全细胞记录方式外， 又陆续发展了膜穿孔记录方式（Perforated patch clamp）、巨 膜片记录方式（Giant membrane patch）、松散封接记录方式 （Loose patch clamp）等等。
（EPC 简介、EPC10 的功能特点及使用等）
Trent Lund 博士 刘 斌 博士
下午
Patchmaster 采集软件的使用
（软件功能、参数设置等）
刘
斌 博士
（14:00 开始） 8月3日 上午 （9:00 开始） 下午 （14:00 开始）
Fitmaster 分析软件的使用
（软件功能、数据处理与分析等）
人类的很多疾病，如： 囊性纤维化（Cystic fibrosis） 癫痫（Epilepsy） 青春晚期糖尿病（MODY） 长QT综合征（Long QT syndrome） 以及多种神经、肌肉疾病，都是由于离子通道功能缺陷所致。 这类疾病被称为离子通道病（Channelopathy）。
离子通道病可由编码离子通道基因的突变引起，也可由编码 调节离子通道的一些蛋白的基因突变引起。 离子通道重要的生理作用以及众多离子通道病的存在，使离 子通道成为新药的热门作用靶点。目前约有20%的注册药物 是通过作用于离子通道而发挥药物作用的，药物通过调节特 定的离子通道功能来影响细胞行为。
四、膜片钳系统的仪器构成
屏蔽网 刺激器 监视器
显微镜
微操纵器
放大器
转换器
探头
防震台
膜片钳系统的仪器构成
单细胞记录系统
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 膜片钳放大器 数模/模数转换器 数据采集分析软件 计算机 倒臵显微镜 显微镜加宽平台 微操纵器：电动、手动 微电极拉制仪 电极抛光仪 浴槽系统 温控装臵 蠕动泵 给药系统 监视系统 防震台和屏蔽网 仪器架 其他：渗透压仪、零配件等 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.
A
大鼠肌球细胞ACh受体单通道电流 D B
电极接触细胞
C
负压吸引形成Ω形膜囊泡
提起电极,囊泡与细胞脱离
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cm H2O的负压 吸引，得到10-100GΩ的高阻封接，大大降低了记录时的 噪声，实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流 的突破。 1981年Hamill、Marthy、Neher、Sakmann和Sigworth等 五人在总结膜片钳技术的基础上对其进行了重大改进，并 完善了游离膜片技术和全细胞记录技术，从而使膜片钳技 术走向成熟，他们的这一重要结果发表在后来的著名杂志 “欧洲生理学杂志（Pflü gers Archive）”上
将电极轻轻地接触细胞， 形成低阻封接 （MΩ）
膜 片 钳 技 术 的 基 本 记 录 模 式
电极 细胞膜 轻轻吸吮， 形成高阻封接 （GΩ）
细胞贴附记录模式 （Cell-attached recording） 继续稍用力吸吮或 给予电击打破细胞膜 迅速提起电极
继续提起电极，使膜片 脱离细胞，形成囊泡 电极内液与 细胞内液沟通
脑片记录系统
膜片钳放大器 数模/模数转换器 数据采集分析软件 计算机 正臵显微镜 显微镜移动平台与支撑平台 微操纵器：电动、手动 微电极拉制仪 电极抛光仪 浴槽系统 温控装臵 蠕动泵 给药系统 红外系统 防震台和屏蔽网 仪器架 其他：渗透压仪、零配件等 切片机 刺激器
EPC 10 Plus膜片钳放大器
（2）应用技术不断涌现 为了更换电极内液和从电极内施加药物，发展了微电极内灌 注技术（Micropipette perfusion technique）； 在研究细胞间的缝隙连接（Gap junction）通道时，发展了 双膜片记录法（Double patch recording）； 将富含神经递质受体的游离膜片靠近突触部位，可检测递质 释放和突触活动，这一技术称为膜片探针技术（Detector-patch technique）； 若将特异的膜片探针插入卵母细胞，可检测细胞内第二信使 含量，此为膜片填塞技术（Patch cramming technique）； 为研究细胞的胞吞与胞吐机制，发展了膜电容测定法（Membrane capacitance measurement）。
1983年第一版
1995年第二版
《Single-Channel Recording》
内尔(Neher) （1944-） （德国细胞生理学家）
萨克曼(Sakmann) （1942-） （德国细胞生理学家）
合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上 存在离子通道。该成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可 揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的 发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获1991年诺贝尔奖。
（3）使用的标本种类繁多 从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元和 内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳窝毛细胞、胃壁细胞、 上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等多种细胞；从 急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到组织片（如 脑片、脊髓片）乃至整体动物；从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾 卵母细胞发展到昆虫细胞、鸡细胞、大鼠细胞、人细胞等等； 从动物细胞发展到细菌、真菌以及植物细胞。此外，膜片钳 技术还广泛地应用到平面双分子层（Planar bilayer）、脂质 体（Liposome）等人工标本上。
（9:00 开始） 下午 （14:00 开始） 8月2日 上午 （9:00 开始）
QPatch 全自动膜片钳介绍
（全自动膜片钳技术概述、QPatch 功能特点介绍 ）
动物呼吸机及麻醉机的选择和应用 脂质双分子层的实验方法
Tracy Price 博士 Ed Buck 博士
ANY-MAZE 视屏软件在动物行为实验中的应用 EPC 系列膜片钳放大器的使用
全细胞记录模式 〈优点〉
（1）便于更换细胞外液，可用于研究电压和配体门控 性离子通道、泵电流、交换体电流等，适合于离子通道药理 学的研究； （2）可进行细胞内灌注，如灌注药物、信使物质、荧 光染料等； （3）可进行细胞内容物的抽吸，如抽取mRNA等； （4）可研究细胞胞吞、胞吐机制。
全细胞记录模式 〈缺点〉
EPC 10 Double膜片钳放大器
• 计算机控制 • 单、双、三、四探头
EPC 10 USB膜片钳放大器
（4）研究对象已经不局限于离子通道 从对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使介导 的离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研 究发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的 研究等。 （5）膜片钳电极已经不单单是传统意义上的电信号记录电极 它还作为其它研究方法的工具使用，如用于进行单细胞 PCR技术时的细胞内容物抽吸工具。 （6）应用范围日趋广泛 为解决实际问题的需要，膜片钳技术已经渗透到生物学领 域的许多学科中，如分子生物学、药理学、免疫学等等，成为生 物学研究中的一种主要技术手段，与其它生物学技术的结合应用 已经成为膜片钳技术的主要发展趋势。
东乐科技有限公司
DL INSTRUMENTS, INC.
第七届膜片钳技术培训班
主办单位
东乐科技有限公司 南昌大学基础医学院 南昌大学心血管研究所 南昌赛尔科学仪器有限公司
2010.8.1 南昌
授课内容
时 间 内 容 主讲人
刘振伟 博士 8月1日 上午
膜片钳技术及其发展概论
（概念、发展历史、发展状况、仪器构成等）
1983年 10月 ， Sakmann 和 Neher主 编 的 《Single-Channel Recording》一书问世，对当时的膜片钳技术进行了全面、 系统的总结，从此奠定了膜片钳技术的里程碑。 1995年，《Single-Channel Recording》一书再版，增添了 大量膜片钳技术的新内容，几乎当时国际上所有的知名膜 片钳专家都参与了编写，成为目前膜片钳技术研究领域的 最经典著作。