粗多糖含量测定方法学验证(范本)

粗多糖含量测定方法学研究资料

一、仪器与试药 (1)

二、方法的研究 (1)

1.检测波长的测定 (2)

2.样品及对照制备方法 (2)

三、方法学验证 (3)

1.线性 (3)

2.精密度实验 (4)

3.稳定性实验 (4)

4.重复性试验 (4)

5.重现性实验 (5)

6.准确度试验 (5)

芪参颗粒粗多糖含量测定方法起草说明

标志性成分粗多糖含量测定的方法来源于《保健食品功效成分检测方法》白鸿主编（中国中医药出版社)的第二法，该方法的原理是：多糖经乙醇沉淀分离后，去除其他可溶性糖及杂质的干扰，糖与硫酸在沸水浴中加热脱水生成羟甲基呋喃甲醛（羟甲基呋喃糠醛），再与蒽酮缩合成蓝绿色化合物，其显色强度与溶液中糖的浓度成正比，在625nm波长下比色测定。

主要研究资料如下：

一、仪器与试药

1、仪器

(1) 离心机（湘南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号TD25-WS）；

(2) 离心管：50ml；

(3) 水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，型号DK-S26）；

(4) 旋涡混合器（DioCote，SA8）；

(5) SHIMADZU UV-1800 紫外可见光分光光度计；

(6) JB760-68 石英比色皿（宜兴市伟鑫仪器有限公司）；

(7) TU-1901 双光束紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；

2、试药

(1) 葡萄糖：广州化学试剂厂，分析纯，批号为20110602-1；

(2) 无水乙醇：西陇化学股份有限公司，分析纯，批号为160802 1；

(3) 蒽酮：国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号为20131127；

(4) 硫酸：广州化学试剂厂，分析纯，批号为20150404-1；

(5) 葡萄糖标准液：标准称取干燥恒重的分析纯级葡萄糖0.5000g，加水溶解，并定容至50ml，此溶液1ml含10mg葡萄糖，用前稀释100倍为使用液（0.1mg/ml）。

(6) 0.1%蒽酮硫酸溶液（W/V）：准确称取0.1g蒽酮置于烧杯中，缓缓加入100ml 80%硫酸溶解，溶解后呈黄色透明溶液。现用现配。

3、试样

(1) 样品颗粒：XXXXX有限公司提供。

二、方法的研究

粗多糖含量测定的方法来源于《保健食品功效成分检测方法》白鸿主编（中国中医药出

版社)的第二法，本研究针对葡萄糖对照以及样品的的吸光度进行检测波长测定，如下所示：1.检测波长的测定

取葡萄糖对照品溶液、样品溶液进行紫外光谱扫描，结果显示对照品和样品均在625nm

2.样品及对照制备方法

（1）样品提取：称取混合均匀的固体样品2.0g，置于100ml容量瓶中，加水80ml左右，于沸水浴中加热1小时，冷却至室温后补加水至刻度（V1），混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀粗多糖。

（2）沉淀粗多糖：准确吸取上滤液（或液体样品）5.0ml（V2），置于50ml离心管中（或2.0ml于15ml具塞离心管中），加入无水乙醇20ml（或8ml），混匀，于4℃冰箱静置4小时以上，以4000r/min离心5min，弃去上清液，残渣用80%（V/V）乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次。残渣用水溶解并定容至10ml（V3）。

（3）标准曲线的绘制：准确吸取葡萄糖标准使用液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml、1.2ml（相当于葡萄糖0mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.10mg、0.12mg）置于10ml比色管中，补加水2.0ml，加入0.1%蒽酮硫酸溶液6ml，在旋涡混合器上混匀，置沸

水浴中加热10min，取出，在流水中冷却20min后，用分光光度计在625nm波长处以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

（4）样品测定：准确吸取样品待测液2.0ml（含糖量20—100μg），按标准曲线绘制步骤于625nm波长下测定吸光度值并求出样品含量。

三、方法学验证

1.线性

取适量葡萄糖对照品，精密称定，加水制成0.1094mg/ml的葡萄糖对照品储备溶液，分别精密吸取葡萄糖对照品储备溶液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml、1.2ml，置于10ml比色管中，补加水2.0ml，依法测定。得标准曲线储备液。依法测定，分别制成含葡萄糖为0、21.88μg、43.76μg、65.44μg、87.52μg、109.40μg、131.28μg的溶液，以吸光度（Y）为纵坐标，葡糖糖对照品的含量（X）为横坐标，绘制标准曲线，见下图，其回归方程为：y=0.00507x+0.0048（r=0.99989），试验表明葡萄糖对照品在0～131.28μg范围内呈良好线性关系。见表1。

表1 线性考察结果

含量

0 21.88 43.76 65.44 87.52 109.40 131.28

（μg）

吸光度（Y）-0.0007 0.1111 0.2209 0.3372 0.4431 0.5561 0.6635 回归方程y=0.00507x+0.0048 r=0.9999

粗多糖标准曲线如下：

粗多糖对照在0～131.28μg内成良好的线性关系。

2.精密度实验

取一供试品溶液，连续测定6次，记录吸光度，结果见表2。试验结果RSD ＜2.0％（RSD ＝0.44％，n ＝6），说明仪器精密度良好。

表2 仪器精密度试验测定结果

序号 吸光度

平均吸光度

RSD ％

1 0.3398 0.3418

0.44

2 0.3414

3 0.3407

4 0.343

5 5 0.343

6 6

0.3419

3.稳定性实验

取同一样品，按以下时间测定，记录吸光度，结果见表3。

表3 粗多糖稳定性试验结果

时间 0min

30min

1h

2h

3h

4h

吸光度

0.3437 0.3409 0.3397 0.3370 0.3342 03313

1hRSD(%) 0.60 2hRSD(%) 0.82 4hRSD(%)

1.35

结果表明供试品溶液在显色反应完成后4小时内稳定。 4.重复性试验

取同一供试品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，并按样品及对照制备方法测定粗多糖含量，结果见表4。

表4 粗多糖重复性试验测定结果（单位：mg/100g ）

样品编号 1 2 3 4 5 6 含量(mg/100ml) 348

343

335

330

335

338

平均含量 338 RSD （%）

1.91