流式细胞仪上机培训手册

流式细胞仪上机操作培训手册

一、样本处理

以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例

1）取样。取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC ；

2）编号。根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管：

a） 1号管：相应同型对照；

b） 2 号管：CD3,CD4,CD8,CD56 四标管；

3）加样。用移液器取100ul细胞/管（约1X106个细胞/管），分别加到已经标记好的流式管底部；

4）洗涤。加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min,离心6min；

5）染色。弃上清，加入100卩l PBS/涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min （操作尽量保持在避光条件下进行。）

6）洗涤。加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；

7）重悬。弃上清，加入0.5ml PBS/管，混匀，上机检测（可选择BD FACSCanto II 或BD Accuri C6）。

（注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4C避光保存。）

8）试验结果分析。（注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。

参考值：

二、上机检测

BD FACSCanto II简要操作流程启动流式细胞仪

i打开流式细胞仪电源

2启动计算机，打开软件登录

3确保软件连接到流式细胞仪

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BD FACSDiva

必要时，点击Cytometer > connect

检查液体水平

1启动流式细胞仪后，检查液体水平

低液面水平或者废液桶满都用红色指示。

BD FACSCanto

2如果液流车未自动开启，选择

Cytometer > Fluidics Startup 。

3当液流启动完成后，点击 OK 关闭对话框。

检查气泡

1在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。

2如果没有看到气泡，进行第 5步。如果看到气泡，点击 Cytometer > Cleaning Modes >

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FACS Flow

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BD FACSDiva

4-2流动室

在此处检查是否右气泡

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淸沽液E

3选择该文件夹，点击 New Experriment 来创建一个新实验。

数据库图标

De-gas Flow Cell.

3当完成信息出现后，点击 OK 。 4如果还可以看到气泡，重复上述操作。

注意：如果打开流动室细胞进口门时出现错误信息，通过关闭进口门，并等待 30秒关

闭该信息。

5当您完成上述操作后，在往下进行之前请先检查激光预热是否已经完成。

BD FACSCanto

BD FACS Diva

创建实验

1按照需要，在工作区工具栏中点击相应的按钮来显示浏览器、细胞仪、检测器、工作表、 获取控制板和双指数编辑器窗口。 2创建文件夹：

A 在浏览器中选择数据库图标，并点击浏览器工具栏上的

New Folder 。

B 对该文件夹命名。

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4对该实验进行重命名。

5选择实验级别的细胞仪设置，然后点击Inspector（检测器）中的Parameters（参数）选项卡。

6按照需要变更，添加或者删除参数。

运行样本并记录数据

1将样品管安装到流式细胞仪中并点击Aquire Data（获取数据）。

A把抽吸臂向左侧推。

B把流式管放置到SIT上，确保试管竖直，并用力向上推试管直到试管完个停止并完个就位。

C把抽吸臂放置到试管下的中心位置。抽吸臂上有这些引脚的中心位置内。3个传感器引脚。试管底部应定位在

2调节FSC和SSC电压以正确显示细胞的散射光特征。

3必要时，点击阈值图标并对FSC阈值进行调节。

4调节P1门仅围绕目的细胞群体。

5调节好后，点击Record Data（记录数据）以记录数据。

6获取停止，取出试管。

建立全局工作表

1如果用户参数中启用了Default global worksheet默认个局工作表）（默认选项），则全局工作表已经存在。展开全局工作表文件夹来定位和重命名工作表。（注：如果Default global worksheet被禁用，则通过点击浏览器工具栏中的New Global Worksheet（新个局工作表）按钮创建个局工作表。）

2使用设计对话框定义参数标记并指定各个试管要记录的细胞颗粒数。标记会出现在点图轴

上和所有的统计结果图中。

A 选择Experiment（实验）＞Experiment Layout（实验布局）。

B在Labels（标签）选项卡中，为试管输入适当的标签。例如，在FITC域中输入CD3。使

用Tab键移动到下一个域。

3在该全局工作表中，创建用预览数据的点图。例如:创建PerCP-Cy5.5对SSC,FITC对APC, FITC 对PE, FITC 对PE-Cy7 和F ITC 对APC-Cy7 点图。

设门

通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。女口：PBMC样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC, SSC的散点图中设门，其数据结果只