大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定_段超

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定

段超　陈鑫　邱志兵　许欢

【摘要】　目的　探讨大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养方法,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。方法　采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测。结果　85%的组织块接种存活,原代培养后2周左右即可传代,至少可以传8代以上,并且细胞形态、生长特点不发生明显的改变,6代的血管平滑肌细胞纯度达97%以上。台盼蓝染色约有94%以上的细胞为活细胞。镜下培养的血管平滑肌细胞呈典型的“谷峰状”生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论　正确地利用组织贴块法可以简单、经济、高效地培养出血管平滑肌细胞,为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。

【关键词】　大鼠;血管平滑肌细胞;原代培养;组织贴块法

P r i m a r y c u l t u r e a n di d e n t i f i c a t i o no f r a t t h o r a c i ca o r t av a s c u l a rs m o o t hmu s c l ec e l l s D U A NC h a o ,C H E N X i n ,Q I UZ h i -b i n g ,X UH u a n .　D e p a r t m e n t o f C a r d i o t h o r a c i c S u r g e r y ,N a n j i n g F i r s t H o s p i t a l A f f i l i a t e dt oN a n j i n gM e d i c a l U -n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210006,C h i n a

【A b s t r a c t 】　O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h e p r i m a r y c u l t u r e m e t h o d o f r a t t h o r a c i c a o r t a v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s (V S M C s ),t o a n a l y z ec e l l g r o w t h a n d b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n dt o p r o v i d e t e s t m a t e r i a l f o r t h e r e s e a r c ho f t h ep r o l i f e r a t i o n o f t h e v a s c u l a r d i s e a s e s .Me t h o d s T h e c u l t u r eo f r a t t h o r a c i c a o r t av a s c u l a r s m o o t h m u c l ec e l l s w a s d o n eb yt i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n .T h e c u l t u r e dc e l l s w e r e o b -s e r v e d a n d i d e n t i f i e d b y m o r p h o l o g y a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w i t hp h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p ea n di m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g r e s p e c -t i v e l y .T h e c e l l v i a b i l i t y w a s d e t e r m i n e dw i t h T y p a nb l u e .R e s u l t s 85%i n o c u l a t e d t i s s u e p i e c e s s u r v i v e d .P r i m a r y c u l t u r e d c e l l s c o u l d b e s u b c u l t u r e da f t e r 2w e e k s a n d s u c c e s s f u l l y p a s s a g e df o r m o r e t h a n 8t i m e s ,w i t h o u t n o t i c e a b l e c h a n g e s i nm o r p h o l o g y a n dg r o w t h c h a r a c t e r -i s t i c s .T h e p u r i t y o f t h e s i x t hp a s s a g e V S M C s w a sm o r et h a n 97%.T h ec e l l v i a b i l i t yw a s m o r et h a n 94%b yt r y p a nb l u e .T h ec u l t u r e d V S M C s s h o w e dt h e t y p i c a l “p e a ka n dv a l l e y ”m o r p h o l o g i c a l a p p e a r a n c e u n d e r m i c r o s c o p e .I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n gw i t ha n t i b o d y a -g a i n s t S M -α-a c t i n d e m o n s t r a t e d t h e s e c e l l s w e r e p o s i t i v e .C o n c l u s i o n T h e m e t h o d o f t i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n c u l t u r e o f V S M C s i s s i m p l e ,e c o n o m i c a n de f f i c i e n t .I t p r o v i d e s a ni d e a l c e l l m o d e l f o r t h e r e s e a r c ho f t h e p r o l i f e r a t i o no f v a s c u l a r d i s e a s e s .

【K e yw o r d s 】　r a t ;v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l ;p r i m a r yc u l t u r e ;t i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n

作者单位:210006　江苏南京,南京医科大学附属南京第一医院心胸

外科

血管平滑肌细胞(v a s c u l a r s m o o t hm u s c l ec e l l s ,V S M C s )的

增殖和迁移是血管增殖性疾病发病的核心环节,其病理学分子机制是近年来血管增殖性疾病的研究热点,也是目前防治的难点[1]。而要获得试验研究所需的血管平滑肌细胞就必须掌握一种简单、经济、高效的血管平滑肌细胞培养方法。本文作者运用组织贴块法进行大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定,并应用多种方法对传代细胞进行纯化,成功地获得了大量纯度较高、生长状态良好的血管平滑肌细胞。

材料与方法

一、材料

150～250g 雄性S D 大鼠,购自南京医科大学试验动物中心。P B S 缓冲液(凯基生物),胎牛血清(海克隆生物),D M E M 培养液/高糖(赛默飞世尔生物),青链霉素混合液(凯基生物),胰蛋白酶-E D T A 消化液(凯基生物),兔抗鼠平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体(北京博奥森生物),S P 免疫组化试剂盒(福州迈新生物),D A B 显色试剂盒(凯基生物)。

二、细胞培养大鼠2～3只,颈椎脱臼致死,75%乙醇浸泡消毒3m i n ,固定后依次剪开胸腹部皮肤,肌肉及胸骨,暴露胸腔,紧靠脊柱右前方,从主动脉弓至膈面处剪下胸主动脉,并放入盛有

P B S 缓冲液的细胞培养皿中,迅速转入细胞培养室的超净工

作台。眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层,然后转移入另一盛有P B S 缓冲液的细胞培养皿中,剪去血管外的小分支。再转移入含20%胎牛血清和D M E M 混合液的细胞培养皿中,眼科直剪剪开血管腔,内膜面向上,以眼科弯镊或手术刀片轻轻擦拭内膜层,以去除内皮细胞。最后转移入另一含20%胎牛血清和D M E M 混合液的细胞培养皿中,用眼科剪将血管段剪成1m m×1m m 大小的组织块,用吸管把组织块转入25m l 细胞培养瓶中,并均匀贴壁于培养瓶底面,组织块的间距为0.5c m 。盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上,并向瓶内注入适量20%胎牛血清和D M E M 混合液以及相应比例的青链霉素混合液,置于37℃,5%C O 2培养箱内放置3～5h ,使得组织块干涸,并与瓶底贴附,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置3天,切勿移动,4～5天会有细胞从组织块周围游离出(见图1),即可换液。

7天左右大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞晕相接触,2周左右组织块周围长出的细胞相互汇合(见图2,3),逐渐铺满整个瓶底时,就可以进行首次传代:弃去瓶中原有培养液,用P B S 缓冲液清洗细胞表面2次,弃去P B S 缓冲液,加入胰蛋白酶-E D T A 消化液4～6滴,使消化液铺满瓶底,入37℃,5%C O 2培养箱中消化2～3m i n 左右,倒置相差显微镜下见细胞收缩变圆、细胞间隙增大(见图4,5,6)时,立即弃去胰酶消化液,用P B S 缓冲液清洗1次,弃去P B S 缓冲液,加入

468临床肺科杂志　2010年4月　第15卷第4期