转氨基作用(精)
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转氨基作用与
氨基酸纸层析
咸宁学院医学院生化教研室
• 一、目的要求：
验证氨基酸的氨基移换作用
了解纸层析基本原理。 初步掌握利用纸层析法分离及鉴定氨基酸的技 术（包括：点样、展层、显色等技术）。
• 二、实验原理：
1、转氨基作用： Ala+α-酮戊二酸
ALT
丙酮酸+Glu
2.层析法
层析法又称色谱法（Chromatography），是广 泛应用的一种生物化学技术。层析法是利用混合物各 组分物理化学性质（如溶解度、吸附能力、电荷和分 子量等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不 同区域，借此将各组分分离。 层析系统有两个相，一个相称为固定相；另一
个相称为流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流
动相的推力影响不同，各组分移动速度各异，从而使
各组得到分离。
按两相所处的状态分类
流动相 液 体 气 体
方法名称
液相层析法（LC）
气相层析法（GC）
固定相
固
体
液
体
固
体
液
体
分离原理
吸Hale Waihona Puke Baidu
附
分
配
吸
附
分
配
方法名称
液-固层析法 （LSC）
液-液层析法 （LLC）
气-固层析法 （GSC）
。由于在同一实验条件下，两相体
B
积比是一常数，所以Rf值决定于分
配系数。不同物质的分配系数不同 ， Rf值也不相同，由此可以根据 Rf 值的大小对物质进行定性分析。
A
溶 剂 展 开 方 向
点样点
三：器材：匀浆器、试管、试管架、滤纸、剪刀
吹风机、层析缸、毛细管、喷雾器。 试剂：（1）0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液 （2）0.1mol/L丙氨酸溶液 （3）0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液
0.5 37℃ 10min 1.0 0.5 1.5
0.5 沸水浴 10min 1.0 0.5 1.5
置37℃水浴中40min，保温完毕，立即将测定管放入沸水中 10min以终止反应，取出冷却后。
3、层析：
①
点样：Ala；Glu；测定管；空白管；（滤纸的 处理，点样3-4次）
②
展层：约25min后，溶剂前缘距滤纸边缘约1cm 时即可取出，用吹风机吹干。
③
显色：0.5%茚三酮用吹风机吹干。
测定管
1
4
谷氨酸
丙氨酸 R=0.8cm 2
滤 纸 条
沿纵轴捻 成灯芯状
3 空白管
实验结果
喷茚三酮吹干后
测定管
1
丙氨酸
4 3
谷氨酸
2
空白管
气-液层析法 （GLC）
按层析的原理分类： 吸附层析法 分配层析法
按操作形式不同分类： 柱层析法 纸层析法
离子交换层析法
凝胶层析法 亲和层析法
薄层层析法
薄膜层析法
纸层析：是利用混合物中各组分在二种不同溶剂中的分配系
数不同而使物质进行分离。
Kd=C2/C1
Kd:分配系数。分配系数大的物质在移动相中的移动速度则缓。
（4）0.1mol/L谷氨酸溶液
（5）0.5%茚三酮溶液
（6）层析溶剂
四、实验操作：
1、肝匀浆的制备：肝2g，0.01M、pH7.4磷酸缓冲液9ml 2、转氨基作用：
加入物（ml） 测 定 管 空 白 管
肝匀浆 放置温度及时间 0.1mol/L丙氨酸溶液 0.1 mol/Lα-酮戊二酸溶液 0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液
C1：物质在流动相中的浓度。
C2 ：物质在固定相中的浓度。 固定相：水（滤纸上，6－7%）。 流动相：苯酚（正丁醇）。
• 溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示：
色斑中心至加样点中心的距离 AB Rf ＝ 溶剂前沿至加样点中心的距离 ＝AC Rf值决定于被分离物质在两相
C
间的分配系数以及两相间的体积比
氨基酸纸层析
咸宁学院医学院生化教研室
• 一、目的要求：
验证氨基酸的氨基移换作用
了解纸层析基本原理。 初步掌握利用纸层析法分离及鉴定氨基酸的技 术（包括：点样、展层、显色等技术）。
• 二、实验原理：
1、转氨基作用： Ala+α-酮戊二酸
ALT
丙酮酸+Glu
2.层析法
层析法又称色谱法（Chromatography），是广 泛应用的一种生物化学技术。层析法是利用混合物各 组分物理化学性质（如溶解度、吸附能力、电荷和分 子量等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不 同区域，借此将各组分分离。 层析系统有两个相，一个相称为固定相；另一
个相称为流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流
动相的推力影响不同，各组分移动速度各异，从而使
各组得到分离。
按两相所处的状态分类
流动相 液 体 气 体
方法名称
液相层析法（LC）
气相层析法（GC）
固定相
固
体
液
体
固
体
液
体
分离原理
吸Hale Waihona Puke Baidu
附
分
配
吸
附
分
配
方法名称
液-固层析法 （LSC）
液-液层析法 （LLC）
气-固层析法 （GSC）
。由于在同一实验条件下，两相体
B
积比是一常数，所以Rf值决定于分
配系数。不同物质的分配系数不同 ， Rf值也不相同，由此可以根据 Rf 值的大小对物质进行定性分析。
A
溶 剂 展 开 方 向
点样点
三：器材：匀浆器、试管、试管架、滤纸、剪刀
吹风机、层析缸、毛细管、喷雾器。 试剂：（1）0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液 （2）0.1mol/L丙氨酸溶液 （3）0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液
0.5 37℃ 10min 1.0 0.5 1.5
0.5 沸水浴 10min 1.0 0.5 1.5
置37℃水浴中40min，保温完毕，立即将测定管放入沸水中 10min以终止反应，取出冷却后。
3、层析：
①
点样：Ala；Glu；测定管；空白管；（滤纸的 处理，点样3-4次）
②
展层：约25min后，溶剂前缘距滤纸边缘约1cm 时即可取出，用吹风机吹干。
③
显色：0.5%茚三酮用吹风机吹干。
测定管
1
4
谷氨酸
丙氨酸 R=0.8cm 2
滤 纸 条
沿纵轴捻 成灯芯状
3 空白管
实验结果
喷茚三酮吹干后
测定管
1
丙氨酸
4 3
谷氨酸
2
空白管
气-液层析法 （GLC）
按层析的原理分类： 吸附层析法 分配层析法
按操作形式不同分类： 柱层析法 纸层析法
离子交换层析法
凝胶层析法 亲和层析法
薄层层析法
薄膜层析法
纸层析：是利用混合物中各组分在二种不同溶剂中的分配系
数不同而使物质进行分离。
Kd=C2/C1
Kd:分配系数。分配系数大的物质在移动相中的移动速度则缓。
（4）0.1mol/L谷氨酸溶液
（5）0.5%茚三酮溶液
（6）层析溶剂
四、实验操作：
1、肝匀浆的制备：肝2g，0.01M、pH7.4磷酸缓冲液9ml 2、转氨基作用：
加入物（ml） 测 定 管 空 白 管
肝匀浆 放置温度及时间 0.1mol/L丙氨酸溶液 0.1 mol/Lα-酮戊二酸溶液 0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液
C1：物质在流动相中的浓度。
C2 ：物质在固定相中的浓度。 固定相：水（滤纸上，6－7%）。 流动相：苯酚（正丁醇）。
• 溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示：
色斑中心至加样点中心的距离 AB Rf ＝ 溶剂前沿至加样点中心的距离 ＝AC Rf值决定于被分离物质在两相
C
间的分配系数以及两相间的体积比