研究肿瘤的淋巴道转移机制浅析

研究肿瘤的淋巴道转移机制浅析

引言转移是恶性肿瘤的最重要标志和最本质表现，也是肿瘤所致患者死亡的最主要原因。早期发现并防止肿瘤转移是改善病人预后的重要手段。因此，肿瘤转移机制及防治已成为当今肿瘤研究领域的热点。Hca-F 和Hca-P 是两株本实验室自行建立的肿瘤转移机制实验模型。

它们是一对高度同源的来自同一小鼠肝癌细胞克隆的不同亚克隆，经615 小鼠局部皮下注射后，特异地向引流淋巴结转移。其中Hca-F 为高转移细胞株，在615 小鼠体内淋巴结转移率，Hca-P 为低转移细胞株，转移率<30%[1~3]。UCH-L3 是泛素C-末端水解酶家族成员之一，泛素系统作用于细胞的许多过程如细胞周期、增殖、凋亡、膜蛋白细胞内摄作用和信号转导等[4,5]。本研究采用细胞免疫化学、Western Blot 和流式细胞术检测了UCH-L3 蛋白在Hca-F 和Hca-P 中的表达情况，进一步探讨UCH-L3 表达与肿瘤淋巴道转移的关系，为解析肿瘤淋巴道转移机制提供新思路。网为您提供医学硕士论文。

材料与方法材料高淋巴道转移力小鼠腹水型肝癌细胞（Hca-F），低淋巴道转移力小鼠腹水型肝癌细胞（Hca-P），由大连医科大学病理教研室建株并保存。近交系615 小鼠，雄性，体重18~22g，由大连医科大学病理教研室繁育并提供[辽实动质字（2000）028 号]。主要试剂 UCH-L3 多克隆抗体购自SANTA CRUZ 公司。

细胞培养将液氮冻存的Hca-F 和Hca-P 细胞迅速融化后清洗两次，离心并收集沉淀将沉淀物溶解在1ml 生理盐水中，以每只小鼠0.2ml 细胞悬液（约2x106 个肿瘤细胞）接种到2 只615 小鼠腹腔内，7 天后无菌条件下抽取腹水并再以相同的量分别接种到2 只615 小鼠腹腔内传代，五天后无菌条件下抽取非血性腹水，离心去上清，经PBS（PH7.4）洗涤一次，再离心，去上清后，将细胞加入含10%新生牛血清的RPMI-1640 培养液（PH7.2）中于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。

免疫细胞化学将培养的HCa-F 和HCa-P 细胞用PBS 重悬为1×106/ml 的细胞悬液，涂片标本经丙酮4℃固定，H2O2 灭活内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭，滴加UCH-L3 一抗，4℃过夜，滴加生物素化二抗，DAB 显色，苏木精复染，脱水透明封片，空白对照选择PBS 代替一抗。

分析用超声破碎法裂解细胞，工作20s，间歇10s，重复20 次，然后8000g、4℃离心取上清。Bradford 比色法测定蛋白质浓度。以12.5%的SDS-PAGE 电泳分离蛋白质样品。电泳后的凝胶用转移缓冲液平衡30min，转至PVDF 膜上40min。用5%TBS/BSA 于37℃封闭，TBS 清洗三次；一抗（山羊抗小鼠多抗，1∶500稀释）4℃孵育过夜，TBS洗三次（次）；生物素标记的二抗，室温反应20min，TBS 洗三次（10min/次）；加入辣根酶标记的链霉菌卵白素工作液，室温反应30min，TBS 洗三次（10min/次）后，用DAB 液于避光处显色，至条带清晰。蒸馏水清洗终止反应，滤纸吸干水分避光保存，实验重复三次。结果经凝胶扫描分析系统, 进行光密度值（Optical density, OD）分析。

流式细胞仪检测将培养的Hca-F 和Hca-P 细胞用PBS 洗三次，离心（1000r/min，5min）收集细胞，用含0.2%Triton X-100 和5%血清的PBS 重悬细胞，置冰上10min。PBS 洗涤3 次，离心（1000r/min，5min），用PBS 重悬为106/ml 的细胞悬液，取200μl 转移至Eppendorf 管中，加

入UCH-L3 多克隆抗体1μl，37℃1h。PBS 洗3 次，离心（1000r/min，5min）；加入标记的二抗各1μl，充分震荡，置冰上40min，PBS 洗3 次，离心（1000r/min，5min）。同时以PBS 代替一抗作为阴性对照。流式细胞仪进行检测，每管计数10000 个细胞。

蛋白在各细胞中的表达以相对荧光强度（Relative fluorescence intensity，RFI）表示，该样品的几何均数(Geo Mean)х 均值(Mean)。

结果免疫细胞化学结果蛋白在两细胞株中均主要表达于胞浆，且在Hca-F 中的表达弱于在Hca-P 中的表达。

分析以β-actin 为内参照，于26KD 处出现单一蛋白质条带，表明在Hca-F 和Hca-P 细胞中均有UCH-L3 的表达，但在Hca-P 细胞中的表达量明显高于Hca-F 细胞，约为1.85 倍。

流式细胞仪分析以只加FITC 标记的二抗作为阴性对照，排除了细胞非特异吸附荧光的影响，因此，流式细胞仪检测结果证实，Hca-F、Hca-P 细胞中确有UCH-L3 的表达，且Hca-P 细胞的表达量约为Hca-F 细胞的1.78 倍。

讨论是泛素C-末端水解酶家族(UCHs)成员之一，目前已成功克隆了在人类和鼠中的种UCHs同工酶，即UCH-L1、UCH-L3、 UCH-L4 和UCH-

L5。其中研究较为深入的是，其两种突变体与人类帕金森病、鼠轴突营养不良关系密切[6，7]。在一些非神经元性肿瘤和神经痛病变组织

中，UCH-L1存在表达异常。

位于人类染色体13q22，有52%的氨基酸序列与UCH-L1同源[8]，分子量为26KD。

通过x线晶体学研究显示，其二级结构是由6条反向平行的β-片层为中心，α-螺旋包绕β-片层各面组成的。两者组合可形成木瓜蛋白酶相关的半胱氨酸蛋白酶。UCH-L3的活化位点有、His169及Asp184等。UCH-L3的mRNA表达涵盖不同组织，尤其在睾丸、胸腺中表达丰富[4]。在泛素途径中，UCH-L3操纵着细胞周期、转录活性、细胞生长和凋亡及突触发生等一系列生理病理过程。

与肿瘤的关系在文献中鲜有报道。Rolen[9]等利用功能蛋白质组学方法分析人宫颈癌HPV携带者及邻近正常组织中泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin specific protease)活性时发现，大部分肿瘤组织中UCH-L3活性上调，提示该酶可能在生长转化中发挥作用。另有报道，在结肠癌免疫应答研究中，发现在结肠癌患者血清中，有19/43检测出存在自身抗体[10]。不难看出，UCH-L3与肿瘤的关系十分密切。有学者认为，UCH-L3能抑制多种促肿瘤生长蛋白的降解[11]。最近，Miyoshi [12]等对100例浸润性乳腺癌中UCH-L1和UCH-L3的mRNA表达水平与不同临床病理特征及患者预后的关系进行了研究，显示在肿瘤组织中水平显着高于癌旁正常组织（P<0.005），而UCH-L1mRNA无显着差异。但二者mRNA水平在组织学分级较高肿瘤中的表达均显着高于较低分级的肿瘤，而且二者mRNA高表达的患者预后较差，易早期复发。

目前尚未见有UCH-L3与肿瘤转移的相关报告。本课题组前期联合应用荧光差异双向凝胶电泳 (2D DIGE)和质谱技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白，在众多差异性蛋白质中，在Hca-P中显着升高[13]。在本实验中，我们通过Western Blot 、流式细胞术等方法检测了UCH-L3蛋白在肝癌淋巴道转移株Hca-F和Hca-P中的表达情况，结果显示，Hca-F中蛋白的表达水平明显低于Hca-P，这与前期研究结果相一致。因此，我们认为UCH-L3的异常表达可能参与肿瘤淋巴道转移，同时，该蛋白在Hca-F中低水平表达可能与Hca-F细胞具有较高转移力相关。

此外，UCH-L3参与细胞凋亡引起了研究者的关注。Yae Sano[14]等发现UCH-L3缺失鼠生后3周龄即表现出光感受器细胞发生凋亡和显着的视网膜变性，尽管此前并无明显的形态学异常。超微结构观察发现，在光感受器内部节段的线粒体嵴和囊泡区域变小；免疫反应性提示，UCH-L3缺失鼠在生后视网膜变性过程中可能通过Caspase 非依赖途径增加线粒体氧化应激相关蛋白如COX（cytochrome coxidase Ⅰ)、以及AIF (apoptosis-inducing factor)等的表达，诱导光感受器细胞凋亡。Kwon [15]等认为和Nedd8之间的相互作用可能引起生殖细胞的凋亡。

截至目前，有关UCH-L3的研究尚不多，凭借已知的生化结构和机理还难以解释和推测其诸多生物学功能和它在肿瘤中发挥的作用，相信随着研究的深入，我们对UCH-L3将会有较为全面的理解和认识。

结论在我们的实验中，UCH-L3蛋白在这两个具有不同淋巴道转移力瘤株中的表达具有显着差异，我们推测，在肿瘤转移过程中，UCH-L3可能参与肿瘤细胞的凋亡。何种机制导致在两种细胞中表达的差异，还有待进一步研究。