基因克隆的技术
基因克隆技术及其在疾病治疗中的应用
基因克隆技术及其在疾病治疗中的应用自从科学家在1996年成功地克隆了一只羊，这一项技术已经在生物技术领域中得到了广泛的应用。
基因克隆技术是指利用生物技术方法来复制与产生相同基因的过程，而且这个过程并不涉及到生殖。
这项技术的出现为我们研究人类基因提供了可能，也能用来治疗一些疾病。
基因克隆技术基因克隆技术主要是利用DNAmolecule中的基因序列复制得到新的DNA片段。
这个过程需要将基因序列放入到一个细胞中然后将其复制得到足够数量的DNA。
这个过程中需要使用许多工具，如PCR(polymerase chain reaction)技术或DNA聚合酶。
同时，这个过程是具有时间和成本的，实验室的研究人员需要精确地进行实验室操作和遵循实验协议，以确保实验的可靠性和有效性。
它有许多应用，如在药物生产、基因工程和给疾病患者做基因治疗中。
它为医学领域提供了许多可能性。
基因克隆技术在疾病治疗中的应用基因克隆技术在生物技术研究领域中应用非常广泛，可进行基因治疗，如肝、肌肉、心脏等器官疾病，还可预防某些疾病的发生。
其中，基因治疗是基于人类基因的一种新疗法，可以通过更改患者的基因来治疗疾病。
基因治疗是一个诱人的想法，它能够治愈许多难治性疾病。
但是，由于该技术仍处于发展阶段，我们还没有发现用这种方式治疗所有疾病的方法。
目前研究的重点集中在一些对人类生存最重要的疾病研究上。
目前有一些使用基因克隆技术治疗疾病的案例，常见的例子有：严重免疫缺陷综合征(SIDS)、透明质酸病、血友病、囊性纤维化等。
血友病是一种血液疾病，患者因为凝血因子不足而面临出血等问题。
通过基因治疗，科学家可以增加病人体内的凝血因子，从而治愈疾病。
在囊性纤维化治疗中，如果我们使用传统的药物，治疗效果并不好。
因此，科学家们将基因疗法作为一种新方法来治疗这种疾病。
通过基因治疗，科学家可以改善患者肺内表皮细胞囊泡的功能，并通过增强纤毛运动来减轻症状。
总的来看，基因治疗可以使得医生们治疗许多疾病有更多选择，对于一些急性疾病治疗会更有利。
基因克隆的技巧
基因克隆的技巧
基因克隆是生物学研究中常用的技术之一，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
以下是基因克隆的一些常见技巧：
1. DNA提取：从源生物体中提取目标基因的DNA。
常见的方法包括溶解细胞膜、蛋白质降解和碱解。
2. 剪切和黏贴：利用限制酶（也称为内切酶）剪切目标DNA，并在相应的酶切位点上黏合连接，形成重组DNA。
3. DNA扩增：通过聚合酶链式反应（PCR）或其他扩增方法，复制目标DNA 片段，以获得足够数量的DNA进行后续实验。
4. 重组载体构建：将目标DNA插入载体DNA，形成重组载体。
载体可以是质粒、噬菌体或其他类型的DNA。
常见的方法包括限制酶消化和连接、启动子和终止子的选择，以及DNA酶切和黏接。
5. 转化：将重组载体导入宿主细胞。
常见的方法包括化学法、电穿孔法和基因枪法。
6. 筛选：使用适当的筛选标记（例如抗生素抗性基因）鉴定并筛选成功转化的细胞。
7. 分离和培养：分离并培养选出的转化细胞，以获得包含目标基因的克隆。
这些技巧在基因克隆中被广泛使用，但具体的操作和条件可能会因实验需求和研究对象而有所不同。
基因克隆技术名词解释
基因克隆技术名词解释基因克隆技术是指通过人工手段将一个生物体的基因从其源生物体中抽取并插入到另一个宿主生物体中的过程。
以下是一些基因克隆技术的常见术语的解释：1. DNA复制（DNA replication）：在细胞分裂或基因克隆过程中，DNA的双链被解开，通过酶的作用，在每个单链上合成一条新的互补链，从而产生两条完全相同的DNA分子。
2. 基因库（gene library）：基因库是一个储存基因序列的集合，通常通过将DNA分子从一个组织或生物提取出来，并将其插入到载体（如细菌或酵母）中来构建。
3. 重组DNA技术（recombinant DNA technology）：重组DNA技术是一种通过将不同来源的DNA片段连接到一起来生成新的DNA分子的方法。
这种方法可用于将特定基因插入宿主生物体的基因组中。
4. 基因放大（gene amplification）：基因放大是指通过体外复制方法制备大量特定DNA序列的过程，如聚合酶链式反应（PCR），从而获得足够量的DNA来进一步研究。
5. 基因表达（gene expression）：基因表达是指基因通过转录和翻译的过程产生功能性蛋白质的过程。
基因克隆技术可以用于将外源基因（来自其他物种）插入宿主生物体的基因组中，从而使宿主生物体表达该基因及其编码的蛋白质。
6. 表达载体（expression vector）：表达载体是一种DNA分子，其中包含了一个外源基因的表达序列，如启动子、转录终止子和转录调控元件等。
表达载体可以在宿主生物体中将外源基因表达出来。
7. 选择标记（selection marker）：选择标记是一种用于帮助筛选转化成功的宿主生物体的方法。
常用的选择标记包括耐抗生素基因，只有含有特定基因的宿主生物体才能在含有相应抗生素的培养基中生长。
8. 基因敲除（gene knockout）：基因敲除是指通过特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）来使宿主生物体中的特定基因失去功能。
基因克隆技术的原理与方法
基因克隆技术的原理与方法在人类历史上，基因一直是科学家们探究的热点之一。
随着科技的不断发展，基因克隆技术逐渐被应用于生物医学和生命科学领域，成为这个领域的重要组成部分。
那么，基因克隆技术的原理和具体方法是什么呢？基因克隆技术的原理基因克隆技术是指通过分子生物学技术，将特定的DNA序列复制并扩增，最终得到大量相同的DNA片段的过程。
在这个过程中，使用的主要技术是PCR和DNA重组技术。
PCR（聚合酶链式反应）是一种将小段DNA片段扩增为大量DNA的技术。
它是一种非常高效的DNA复制方法，经过多次扩增可以得到数百万、数千万甚至数十亿倍的DNA。
DNA重组技术是一种将两个不同种类DNA片段组合成一个新的DNA分子的方法。
这个过程通常包括三个步骤：1）通过限制性内切酶切割DNA，得到特定的DNA片段；2）将这些DNA片段与载体DNA序列进行融合；3）通过转化或转染等方法将重组后的DNA引入宿主细胞中，让它开始复制。
利用PCR和DNA重组技术，科学家们可以快速扩增任何一种特定的DNA序列，或者将不同DNA序列进行组合重组，从而高效地制造出人工合成的DNA序列。
同时，这些技术还可实现基因靶向分析、疾病诊断、基因治疗等多种应用。
基因克隆技术的方法通过PCR和DNA重组技术，科学家们可以使用多种不同的方法实现基因克隆。
下面我们就来介绍一些常用的基因克隆方法。
1. 基本的基因克隆方法这种克隆方法包括PCR扩增和限制性内切酶切割，并且可以使用装载体如质粒或病毒来转化宿主细胞。
这种克隆方法常用于基因分析、疾病诊断中。
2. 聚合酶链式反应（PCR）法PCR法是一种基于DNA聚合酶在适当条件下的多次循环扩增DNA片段的技术。
具体步骤如下：将DNA分子用特定的引物扩增引导器识别特定的DNA，然后将扩增反应放到恒温器中进行放大，每循环一次会将扩增的DNA片段分裂成两条链，出现两个新的单链DNA前体，从而实现了DNA聚合。
3. 环状扩增法环状扩增法适用于小片段DNA的克隆，其具体步骤是：用引物识别特定的DNA，然后使用聚合酶以及低成本的环形引物扩增DNA片段。
基因的克隆方法大全
1.2.3 差异显示PCR〔DD RT-PCR〕
最先由Liang等于1992年报道,目前已广 泛在实验室使用.
主要LY〔A〕结构,在其3`端设计象5`-
T11GA样引物,该引物可与mRNA总数的
十二分之一结合,从而使这部分基因得到
逆转录,同时结合5`端的随机引物〔20条
染色体 T-DNA
染色体 目的基因野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析2，4 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因 子,实际上也是DNA片段,它可以在生 物的染色体组中移动,从染色体的一个 位点跳到另一个位点,或从一条染色体 跳到另一条染色体上,引起基因功能的 改变.
8
已发展的相应基因克隆方法：
差减杂交〔SH〕 抑制性差减杂交〔SSH〕 差异显示PCR〔DD RT-PCR〕 DNA代表性差异分析〔DNA RDA〕 扩增限制性片段长度多样性〔AFLP〕 cDNA微阵列
9
差减杂交〔SH〕
最早由Lamar和Palmer于1984年提 出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究.
10-mer〕,可m以RN使A不同长度的基因得到扩
增5. `
RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
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15
mRNA
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41
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。
本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。
一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。
基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。
2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。
3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。
通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。
通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。
例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。
二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。
基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。
基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。
常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。
3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。
4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。
可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。
基因克隆与表达
基因克隆与表达基因克隆与表达是生物学领域中重要的技术手段和研究方法。
通过基因克隆和表达，科学家能够研究特定基因的功能、调控机制以及其在生物体内的作用，这对于深入了解生物体的生理过程和疾病发生机制具有重要意义。
本文将介绍基因克隆与表达的原理、方法以及应用。
一、基因克隆基因克隆是将特定基因从一个生物体中分离并复制到另一个载体中的过程。
这个过程主要涉及DNA的分离、复制和连接。
常用的基因克隆技术包括PCR、限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳和基因插入等。
1. PCR聚合酶链反应（PCR）是一种强大的基因扩增技术。
它通过不断地重复某一特定区域的DNA序列，使其得以大规模复制。
PCR可以在短时间内合成大量目标DNA片段，为基因克隆提供了充足的材料。
2. 限制性内切酶切割限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列。
通过选择合适的限制性内切酶，可以实现将目标基因从源DNA中切割下来，为下一步的基因克隆做好准备。
3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术。
通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，并施加电场，DNA片段会根据其大小在凝胶中迁移。
凝胶电泳可以帮助科学家分离和纯化目标基因。
4. 基因插入基因插入是将目标基因连接到载体上的过程。
载体可以是质粒、病毒或者人工染色体等。
通过连接酶的作用，目标基因与载体可以稳定地结合在一起。
二、基因表达基因表达指特定基因通过转录和翻译过程转化为蛋白质的过程。
从基因克隆到基因表达，可以分为以下几个步骤：转染或转化、筛选和检测。
1. 转染或转化转染是指将外源DNA导入到动物细胞中的过程，而转化是将外源DNA导入到细菌细胞中的过程。
转染和转化可以通过多种方法实现，如化学法、电穿孔法和基因枪法等。
2. 筛选筛选是为了确定是否成功将目标基因表达在宿主细胞中而进行的步骤。
常见的筛选方法包括荧光筛选和克隆筛选。
荧光筛选利用荧光蛋白标记目标基因，观察细胞是否出现荧光信号。
克隆筛选则利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的克隆。
生物技术中的基因克隆技术
生物技术中的基因克隆技术随着科技的不断进步，生物技术已经逐渐成为科学和社会领域的重要组成部分。
其中，基因克隆技术是生物技术领域中最为重要的技术之一。
基因克隆技术可以通过对基因进行精准的复制和编辑，为人类和其他生物提供各种不同的应用场景。
本文将对基因克隆技术做出详细的介绍和分析。
一、什么是基因克隆技术基因克隆技术是利用生物技术手段对生物体内的DNA分子进行复制和编辑的技术。
在基因克隆技术中，科学家通常会从一个特定的源生物体中获取目标基因序列，随后将其进行分离、转录、复制、编辑等多种操作，最后再将其重新结合在一起，形成一个与原始基因序列完全相同或类似的新的基因序列。
这种技术主要是通过对基因序列进行分析，来寻找和筛选出特定的基因序列，并利用PCR、电泳、DNA序列分析等各种技术手段以非常高的精确度对基因进行复制和编辑。
二、基因克隆技术的应用基因克隆技术的应用领域非常广泛。
以下是一些基因克隆技术的主要应用领域：1. 生命科学研究：基因克隆技术可以使科学家更方便和精准地研究各种生物体的基因信息和遗传学性质，以进一步深入了解生命的进化和发展机制。
2. 医学：基因克隆技术对于人类医学的发展有重要的启示作用。
例如，基因修饰技术可以用于创建更加安全和有效的药物、诊断和治疗各种疾病的方法，如癌症、心血管疾病等。
3. 农业：基因克隆技术可以用于改良作物、畜禽的品质和产量。
如可以利用这种技术改造作物的基因，提高作物的抗病性、耐旱性、抗旱性等，以适应更加恶劣的生长环境和气候条件。
4. 工业：基因克隆技术还可以应用于工业领域中的生产和制造过程中。
例如，可以利用这种技术生产更加安全和环保的生产原料，或者生产更好的生物燃料、清洁能源等。
三、基因克隆技术的风险与限制尽管基因克隆技术有着广泛的应用前景，但是它也存在着各种风险和限制。
例如：1. 伦理风险：基因克隆技术的应用可能引发一些伦理和道德方面的争议。
例如，人类克隆技术可能会导致人类社会面临诸如基因种族歧视、大规模“定制”的情况等问题，甚至可能威胁到人类的存在和生存。
基因克隆的方法
基因克隆的方法基因克隆是一种将特定的DNA片段从一个组织或生物体中复制并插入到另一个生物体中的技术。
这种技术已经帮助我们研究和理解生命过程的许多方面，包括遗传学、发育生物学和分子生物学等领域。
基因克隆的方法通常包括以下几个步骤：1. DNA片段的提取首先，需要从源组织或生物体中提取出含有目标基因的DNA片段。
这可以通过使用化学物质或机械方法来破坏细胞壁和细胞膜来完成。
然后，可以使用酶切（酶切），即将DNA 分子切割为多个部分，以获取需要的DNA片段。
接下来，需要将目标基因片段插入到载体DNA中，这种DNA通常来自细菌或病毒。
这些载体通常被称为质粒，由于它们可以独立地复制和转移到不同的生物体中，因此它们是进行基因克隆的理想选择。
这个过程的关键是要使用酶切和酶连反应将基因片段和质粒DNA连成一体。
3. 转化完成DNA插入之后，需要将质粒DNA插入到目标生物体中。
这个过程通常被称为转化。
质粒DNA可以通过添加化学物质，电击或热冲击等方法，使其进入目标细胞中。
如果转化成功，则目标细胞将含有与原细胞相同的基因，并且可以将该基因传递给其细胞后代。
4. 克隆筛选最后，需要进行克隆筛选，以确定哪些细胞包含所需的质粒和基因。
可以通过对转化沿用枝接派系进行筛选，这些派系通常包含一些荧光标记或抗生素耐受基因。
这样，只要细胞包含标记，就可以通过添加抗生素来杀死不含标记的细胞，从而将所需的基因克隆出来。
在生物技术的发展中，基因克隆的方法已经得到了广泛应用。
它可以用来生产抗生素、激素和其他药物，也可以用来改变植物和动物的遗传特征，以增加其产量或提高其抗病能力。
基因克隆还可以用来研究基因功能，发现新的基因或揭示遗传疾病的机制。
但是，由于基因克隆涉及到对生命体系进行干预和修改，因此我们必须注意其潜在的风险和不良后果，并确保其在道德和法律方面的合规性和可行性。
基因克隆的原理与技术
基因克隆的原理与技术在现代生命科学领域中，基因克隆是一个非常重要和广泛应用的技术。
基因克隆可以为人们研究生物体的基因组、分子生物学、药物研制、治疗等方面提供可靠的技术支持，同时也为人们更深层次地认识生命的本质提供了洞见。
本文将介绍基因克隆的原理和技术。
1. 基因克隆的原理基因克隆的原理是利用DNA重组技术，将目标基因插入到载体DNA中，再利用细胞转化技术将其导入到宿主细胞中，使其得以复制扩增，达到大规模表达目标基因的目的。
首先，需要准备一段目标基因的DNA序列，这由分子生物学技术提供。
然后，需要构建一个DNA载体，如质粒，它是一个小的环状DNA分子，可以复制自己并携带外源基因。
目前常用的载体包括pUC和pET等。
这些载体还可以携带各种标记，如荧光标记或抗生素抗性基因等。
将目标基因插入质粒中，需要利用特定的酶切和连接反应。
通常，酶切是使用一种名为限制性内切酶的酶切割DNA分子特定的位置，以产生产生单一或多个特定长度的DNA断裂点。
连接反应可以将目标基因和含有适当酶切位点的质粒连接在一起，形成重组质粒。
这些重组质粒可以通过传统的分子生物学方法，如PCR和电泳，进行筛选和鉴定。
2. 基因克隆的技术构建重组质粒之后，需要将其导入到细胞中。
有多种方法可以实现细胞转化，包括热冲击法、电转导法和化学法。
这些方法基本上都涉及到增加细胞膜的通透性，使DNA能够进入细胞质。
在宿主细胞中，携带外源基因的重组质粒可以通过自我复制产生的子代细胞中，随着细胞的繁殖，这些子代细胞也将继续复制重组质粒，从而实现目标基因的大规模表达。
同时，也可以通过选择抗生素筛选等方法来筛选能够稳定表达目标基因的细胞株。
基因克隆技术不仅可以实现外源基因的表达，还可以进行多种蛋白质修饰和改变其结构特性，从而产生更加优越的药物。
此外，基因克隆技术还可以进一步应用于基因疗法等领域中，实现个性化治疗和药物研发。
3. 基因克隆的前景和挑战基因克隆技术的应用已经在多个领域得到了成功。
基因克隆技术
第五章基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。
基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。
在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。
有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。
基因克隆的一般程序为：一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法：1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
基因工程中的基因克隆技术详解
基因工程中的基因克隆技术详解基因工程是现代生物技术领域中的一个重要领域，其核心是基因的克隆技术。
基因克隆技术是指将某一物种的基因从其DNA分子中剪切出来，然后通过重组DNA技术将其插入到宿主细胞的染色体中，使宿主细胞能够表达并产生与原生物种相同的特定基因产物。
基因克隆技术的应用广泛，不仅在医学领域中有着重要的意义，还在农业、工业等领域有着广泛的应用。
基因克隆技术分为几个基本步骤：选择目标基因、制备DNA片段、构建载体、转化宿主细胞、筛选目标基因和验证。
首先是选择目标基因，这需要根据具体需求和研究目的来确定。
制备DNA片段通常可以通过PCR（聚合酶链反应）或DNA酶切来实现。
PCR是一种体外复制技术，它通过DNA聚合酶酶和特定引物在高温下反复扩增目标DNA片段。
DNA酶切是利用特定的酶切酶切割DNA，得到所需片段。
构建载体是将目标基因插入到载体DNA中的过程。
载体DNA通常是质粒（如pUC19、pET28a等）或病毒（如腺相关病毒、腺病毒等）。
转化宿主细胞是将构建好的载体DNA转入某种特定宿主细胞中的过程。
目前常用的转化方法有热冲击法、电穿孔法和基因枪法等。
筛选目标基因是在宿主细胞中鉴定并筛选出目标基因的过程。
通常是通过抗生素抗性基因或荧光标记基因的选择来实现。
最后，通过验证目标基因是否成功克隆，可以采用PCR、Southern blotting（南方杂交）或DNA测序等方法进行验证。
基因克隆技术的应用非常广泛。
在医学领域中，基因克隆技术被广泛应用于基因治疗、疾病诊断和药物研发等。
通过基因克隆技术，可以将正常基因导入患者体内，治疗一些遗传性疾病。
而在农业领域中，基因克隆技术可以用于改良作物、提高农作物的产量和抗性，以应对全球粮食安全的挑战。
此外，基因克隆技术还可以用于工业发酵中的酶的生产和合成新的生物小分子。
然而，基因克隆技术也存在一些争议和挑战。
首先，基因克隆可能引发道德和伦理问题，例如对于人类胚胎克隆的争议。
基因克隆技术的原理及应用
基因克隆技术的原理及应用1. 基因克隆技术的引言基因克隆技术是生物学领域中一项重要的实验技术，被广泛用于基础研究、生产应用、医学诊断等领域。
本文将介绍基因克隆技术的原理以及其在不同领域的应用。
2. 基因克隆技术的原理基因克隆技术是指将感兴趣的DNA片段从一个有机体中复制到另一个有机体的过程。
它主要包括DNA片段的获取、载体的选择、转化和筛选等步骤。
2.1 DNA片段的获取DNA片段可以通过多种方法进行获取，包括PCR、限制性内切酶切割、合成以及基因库筛选等。
其中，PCR是最常用的方法之一，通过酶连锁反应可以扩增目标DNA片段。
2.2 载体的选择克隆过程中需要选择一个合适的DNA载体来承载目标DNA片段。
常见的载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
选择载体时需要考虑载体的大小、复制能力、表达能力等因素。
2.3 转化将目标DNA片段与选定的载体进行连接后，需要将复合物转化到宿主细胞中。
转化可以通过化学方法、电穿孔等方式实现。
转化后的细胞将能够持续地复制目标DNA片段。
2.4 筛选为了筛选出含有目标DNA片段的克隆体，可以利用选择性培养基、荧光标记、抗生素抗性等方法进行筛选。
筛选后的克隆体可以进一步进行纯化和验证。
3. 基因克隆技术的应用基因克隆技术在许多领域都得到了广泛的应用，下面将介绍其在基础研究、生产应用和医学诊断中的应用。
3.1 基础研究基因克隆技术在基础研究中起到了至关重要的作用。
通过克隆和研究特定基因，科学家可以深入了解基因的结构、功能以及相互作用关系。
这对于研究生物学基本原理、探索疾病机理等具有重要意义。
3.2 生产应用基因克隆技术在农业、药物生产和工业生产等领域都有广泛的应用。
例如，农业方面可以利用基因克隆技术改良作物品种，提高产量和抗病性；药物生产方面可以利用基因克隆技术大规模生产特定蛋白质，用于制造药物；工业方面可以利用基因克隆技术生产高效酶、清洁能源等。
3.3 医学诊断基因克隆技术在医学诊断中的应用也越来越广泛。
基因克隆的原理
基因克隆的原理
基因克隆是指通过重组DNA分子来复制或复制特定基因的过程。
它的原理涉及利用DNA重组技术从一个生物体中提取目
标基因，并将其插入到另一个宿主生物体的基因组中。
以下是基因克隆的基本原理和步骤：
1. 提取目标基因：从一个生物体的DNA中提取目标基因。
这
可以通过多种方法实现，如聚合酶链式反应（PCR）或酶切和连接技术。
2. 槽融合：使用合适的酶将目标基因与质粒DNA或其他载体DNA相连接。
这些质粒DNA通常是经过改造的DNA分子，
包含有关目标基因的所需信息，如启动子、激活子和选择性标记。
3. 转化宿主细胞：将重组质粒DNA导入到宿主细胞中。
这可
以通过多种方法实现，如电穿孔、化学转化或基因枪。
宿主细胞通常是细菌或酵母等单细胞生物。
4. 选择性筛选：使用特定的标记或抗生素等方法筛选出已经成功转化的宿主细胞。
这有助于确保目标基因已经被插入到宿主细胞的基因组中。
5. 复制和表达：将含有目标基因的宿主细胞进行培养和繁殖，以实现大规模的基因复制。
通过适当的培养条件和诱导剂等方法，目标基因可以被表达出来，并产生所需的功能蛋白或产物。
总的来说，基因克隆基于DNA重组技术，利用质粒DNA或其他载体DNA将目标基因导入宿主细胞的基因组中。
这种方法使得科学家能够通过修改和复制基因，研究基因功能、制备蛋白质或生产其他有用的化合物。
克隆技术的原理和应用
克隆技术的原理和应用克隆技术是通过人为方式复制生物体的基因信息，从而实现在实验室中复制一个完全相同的个体。
该技术的发展和应用领域非常广泛，涉及到生物医学研究、农业、畜牧业等多个领域。
本文将介绍克隆技术的原理和应用。
一、克隆技术的原理克隆技术主要有两种方式：基因克隆和生殖克隆。
1. 基因克隆基因克隆是将感兴趣的基因从一个生物中提取出来，然后通过人工手段将其复制并插入到另一个生物体中。
基因克隆的主要步骤包括：（1）从DNA中提取目标基因；（2）通过PCR技术复制目标基因；（3）插入到质粒或病毒载体中；（4）将质粒或病毒载体导入宿主细胞；（5）宿主细胞表达目标基因。
2. 生殖克隆生殖克隆是指通过体细胞核移植的方式，从一个个体中提取细胞，并将其细胞核植入到另一个无核细胞的卵细胞中，使其发育成一个完整的个体。
生殖克隆的主要步骤包括：（1）提取供体个体的体细胞；（2）移除受体卵细胞的细胞核；（3）将供体个体的细胞核植入受体卵细胞中；（4）激活卵细胞发育；（5）将胚胎移植到母体中继续发育。
二、克隆技术的应用1. 生物医学研究克隆技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
通过克隆技术可以获得大量具有相同基因信息的实验模型，用于研究疾病的发生机制、创造新的药物和治疗方法等。
此外，克隆技术还可以用于修复或替代有缺陷的组织和器官，推动组织工程和再生医学的发展。
2. 农业领域克隆技术在农业领域的应用主要集中在植物育种和种畜禽繁殖方面。
通过克隆技术可以快速繁殖高产、抗病虫害的优良品种，提高农作物和经济作物的品质和产量；在畜牧业方面，克隆技术可以用于繁殖优质的牛、猪、羊等家畜，提高其育种速度和品质。
3. 保护濒危物种克隆技术可以应用于保护濒危物种。
通过采集和保存濒危物种的组织样本，然后利用克隆技术，可以复制出许多相同基因信息的个体，从而增加濒危物种的数量，提高其生存率。
4. 法医学应用克隆技术在法医学领域也有重要的应用。
通过克隆技术可以在刑事犯罪中利用DNA信息对肇事者进行追踪和定位；同时，可以通过克隆技术获得嫌疑人的基因信息，用于法医鉴定和司法调查。
基因克隆技术的原理与应用
基因克隆技术的原理与应用基因克隆技术，是一种人工制造基因的方法。
基因是控制生物体形成和功能的分子，通过克隆技术可以制造出大量基因，进而研究和探究生命的奥秘。
本文将会阐述基因克隆的基本原理和应用。
一、基本原理基因克隆的基本原理是将所需的基因片段从一个生物体中取出，并在实验室中引入另一个生物体中。
这个过程需要借助于限制性内切酶、连接酶和载体等工具，并通过PCR（多聚酶链式反应）方法扩增目标DNA片段。
1.限制性内切酶限制性内切酶，简称限制酶，是用于切割DNA的酶。
它通过识别某些具有特定核苷酸序列的DNA区域，并在这些区域特定的位置切割，从而产生双链断裂。
这些特定的核苷酸序列称为限制性内切位点。
限制酶常用于对DNA进行切割和克隆。
2.连接酶连接酶的主要功能是将两个DNA片段连接在一起。
它通过催化DNA的磷酸二酯键形成和破坏，使两个DNA片段能够连接起来。
在基因克隆中，连接酶一般会用于将DNA插入载体。
3.载体载体是指用于转运DNA的分子，主要应用于克隆和表达DNA。
在基因克隆中，载体一般采用质粒，将目标DNA片段通过限制酶和连接酶等工具与载体连接起来，形成一个基因克隆体。
二、应用基因克隆技术在生物学、医学、农业和工业等领域都有较广泛的应用。
1.检测和诊断基因基因克隆技术可以检测和诊断基因相关疾病。
例如，通过基因克隆技术可以克隆出某个基因，然后用PCR扩增出其变异位点，并与正常组织进行比较，进而确定该基因是否发生了突变，从而诊断出相应的疾病。
这项技术应用非常广泛，已经被广泛应用于医学诊断中，如癌症、肌萎缩性脊髓侧索硬化等疾病的检测和诊断中。
2.改良农作物基因克隆技术可以改良农作物，增加其产量和抗病能力，改善物种适应环境的能力。
例如，研究人员通过基因克隆技术将某些耐旱基因和抗病基因等，插入到某个农作物中，进而使该农作物在恶劣环境中更加适应和生存。
此外，基因克隆也可以用于改良果蔬的营养成分，使其更加营养丰富，提高人体的健康水平。
基因克隆技术及其在基因工程中的应用
基因克隆技术及其在基因工程中的应用基因克隆技术是一项重要的生物学研究方法，它可以将生物体的DNA分子复制出来、扩增并在不同的载体中进行传递、存储和表达。
基因克隆技术在生物工程和基因治疗等领域中有着广泛的应用，本文将重点介绍这项技术的原理、过程和具体应用。
I. 基因克隆技术的原理和过程基因克隆技术主要包括DNA分子的分离、切割、连接、转移和检测等基本过程。
下面将分别介绍这些过程。
1. DNA分子的分离DNA分子的分离是基因克隆技术的第一步。
通常，我们需要从生物体的细胞或组织中，通过化学或物理手段将粗提或纯化出DNA样品。
2. DNA分子的切割切割DNA分子是基因克隆技术的关键步骤，其目的是将DNA分子切成特定的片段，并生成具有黏性末端的DNA分子，以便后续的连接。
DNA切割一般使用限制性内切酶，这些酶能够将DNA分子特定的序列切割成各种长度的片段。
切割后，黏性末端可以通过酶切修复、平端化和生化修饰等方式进行修复和处理。
3. DNA分子的连接DNA分子的连接是指将DNA片段和载体DNA块连接在一起，形成重组DNA 分子。
载体DNA块通常来源于大肠杆菌、酵母等，常用的载体包括质粒、噬菌体等。
将DNA片段和载体DNA块进行连接，需要使用DNA连接酶，通过黏性末端的互补配对，将DNA片段连接到载体DNA块上。
4. DNA分子的转移DNA分子的转移是将重组DNA分子导入到目标宿主细胞中的过程。
这通常使用电转化、热冲击或微注射等方法进行。
DNA分子进入宿主细胞后，通过复制过程，可以扩增DNA分子。
5. DNA分子的检测DNA分子的检测是对重组DNA分子进行鉴定和确认的过程。
目前常见的DNA检测方法包括PCR、DNA测序和Southern blot等技术。
通过对重组DNA分子进行检测，可以确定其是否达到预期效果。
II. 基因克隆技术在基因工程领域的应用基因克隆技术在基因工程领域中有着广泛的应用，下面将分别介绍基因工程中常用的几种基因克隆技术及其应用。
基因克隆实验实验报告
一、实验目的本实验旨在学习基因克隆的基本原理和操作步骤，掌握DNA提取、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、筛选等基因克隆技术，并对实验结果进行分析。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
本实验采用以下原理：1. DNA提取：利用细胞裂解、蛋白酶K处理、酚/氯仿抽提等方法提取目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：利用限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列，并在这些序列上切割DNA分子，产生具有黏性末端或平末端的DNA片段。
3. 连接：利用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接，形成重组DNA分子。
4. 转化：将重组DNA分子导入宿主细胞，使其在细胞内复制、表达。
5. 筛选：通过分子生物学方法筛选出含有目的基因的细胞株。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR引物、酚/氯仿、无水乙醇、氯仿等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、紫外分光光度计、DNA纯化仪、PCR仪、电热恒温培养箱等。
四、实验步骤1. DNA提取：取一定量的大肠杆菌DH5α菌液，加入细胞裂解液，充分振荡，加入蛋白酶K，37℃水浴30min，加入酚/氯仿抽提，离心，取上清液，加入无水乙醇沉淀，离心，洗涤，溶解，得到目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：将目的基因片段和载体pUC19分别进行限制性核酸内切酶酶切，酶切产物经电泳鉴定后，切胶回收酶切产物。
3. 连接：将切胶回收的目的基因片段和载体pUC19在连接酶的作用下连接，连接产物经电泳鉴定后，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4. 转化：将连接产物加入大肠杆菌DH5α菌液中，在冰浴中振荡，加入CaCl2，热冲击，涂布于含有抗生素的琼脂平板上，37℃培养过夜。
5. 筛选：挑选单菌落，进行PCR扩增，鉴定阳性克隆。
基因克隆技术及其在蛋白表达中的应用
基因克隆技术及其在蛋白表达中的应用基因克隆技术是一种将外源DNA片段转化到DNA质粒中的技术，其产物为克隆DNA分子。
这种技术可以应用于如生物医学、农业等领域中的研究和应用。
其中，蛋白表达是基因克隆技术的一个重要应用方向。
1. 基因克隆技术的原理和方法基因克隆技术的原理大致分为三个步骤：DNA分子的制备、限制性内切酶切割、DNA片段连接到载体DNA上。
DNA分子的制备涉及DNA提取、PCR扩增、酶切等技术，目的是获得含有目标DNA片段的DNA。
限制性内切酶切割是将DNA分子切割成特定的片段，目的是获得目标DNA片段。
DNA片段连接到载体DNA上是通过连接酶将DNA片段与载体DNA连接成DNA重组物质。
同样的，基因克隆技术的方法分为三种：限制性内切酶法、PCR扩增法和基因文库法。
2. 蛋白表达及其意义蛋白表达是指基因的DNA序列转化为相应的蛋白质。
蛋白质在生命体内十分重要，它们构成了生物体的各种器官和组织的结构，并且承担着许多生物学过程的重要作用，如酶的催化作用、免疫系统的维持、基因的调控等。
因此，蛋白表达在生物医学、农业等许多领域中具有无限的应用前景，包括生物药物生产、食品安全、草地生态建设等。
3. 基因克隆技术在蛋白表达中的应用基因克隆技术在蛋白表达中的应用主要分为两种：原核表达和真核表达。
原核表达是将外源DNA片段转化到大肠杆菌等细菌中，使其在细菌内部表达并获得蛋白质。
这种方法无需使用复杂的细胞系统，适用于简单的蛋白质表达。
真核表达是将外源DNA片段转化到哺乳动物或其他真核生物的细胞中，使其在细胞中表达并获得蛋白质。
这种方法对于复杂的蛋白质表达和修饰更为有效。
4. 基因克隆技术在生产生物药中的应用基因克隆技术在生产生物药方面的应用十分广泛。
这种方法的基本思想是：将人类基因移植到可表达该基因的外源宿主细胞中，并使该宿主细胞制造有效的蛋白质。
基因克隆技术可以生产生物药，如干扰素、人免疫球蛋白、重组胰岛素等，这些生物药可以更准确地控制疾病的进程，减轻患者的痛苦，并提高治愈率。
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基因克隆技术摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。
本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。
关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子ABSTRACT：Gene cloning technology is the core of molecular biology technology, its purpose is obtain a gene or DNA fragments of the copy, used for in-depth analysis the structure and function of genes, and may achieve human cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the following several aspects to introduce gene cloning technology: the purpose of the gene for the purpose, genes and carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification.Keywords：purpose gene;restriction endonuclease;clone;restructuring molecules基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。
“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
1. 目的基因的获得目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。
获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。
基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。
所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。
常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1] 1.1 PCR方法1.1.1 PCRPCR 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA[2]。
聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制[3]。
PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40～60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍[4]。
1.1.2 RT-PCR反转录PCR（RT-PCR）又称为逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA 的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。
其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术[4]。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。
1.1.3 real—time PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国applied biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规的PCR相比，它具有特异性更强，灵敏度高，重复性好，定量准，等优点，目前已得到广泛应用[5]。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR技术不仅广泛地应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于兽医临床。
其应用涉及到的范围包括病原体的检测、基因表达的定量和等位基因的鉴定等多个领域[6]。
实时定量PCR反应是在带透明盖的塑料小管中，激发光可以直接透过管盖，使其中的荧光探针被激发。
荧光探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA结合后，才能够被激发发出荧光。
随着新合成目的DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光相应增加[3]。
Woo等[11]利用SYBR Green I作为荧光染料建立了一种鉴定钩端螺旋体的方法，利用熔点曲线分析来区别特异产物、引物二聚体和非特异性产物，不需要电泳来鉴定，该方法快速而敏感，整个过程在20 min 内完成。
Jamest 51等应用TaqMan探针建立了从小牛腹泻粪便中定量检测水源性寄生虫小隐孢子虫的C j基因和18S rRNA的方法。
Frank等[12]建立了基于TaqMan 探针的实时RT-PCR方法，从感染马传染性贫血病毒(EIAV)的马血浆中定量检测EIAV的荷裁量，比竞争性RT—PCR更省事，有更大的检测范围。
1.2 基因组文库或cDNA文库的构建和筛选将基因组DNA用限制性内切酶消化后插入到适当载体中，得到含有不同插入片段的克隆载体，这种克隆载体的混合物含有长短不同的基因组片段，这就是基因文库。
若将细胞内所有mRNA均逆转录成cDNA，然后将所有cDNA片段克隆到适当的载体中，构建成含有不同cDNA片段的克隆载体混合物，这就是cDNA文库。
cDNA 的合成可用RT - PCR 法，也称反转录PCR[9]。
它是一种酶促合成法, 即以mRNA为模板, 在反转录酶的作用下, 以4 种脱氧核苷三磷酸为材料合成DNA(cD NA), 再经复制后即成双链DNA。
从真核生物中提取mRNA, 由于mRNA 后有100- 200 bp 的Poly(A), 用与Poly(A)互补的12- 18个核苷酸的Oligo (dT) 合成的一种组织中所有mRNA 对应的cDNA 第一链。
然后使用末端转移酶在cDNA 第一链末端加上多聚C, 经变性和水解mRNA 后, 加入1 个末端为多聚G 的引物合成其互补链( 第二条链) , 再经PCR 进行大量扩增。
因为真核生物的基因由编码的外显子和大量不编码的内含子两种序列组成, 用这种方法得到的基因没有内含子, 不具有启动子和终止子, 所以缺乏功能活性。
如果外接一段调节序列, 就能在受体细胞中表达, 所以此法是克隆真核生物基因的有效方法[7]。
自从1970年Temin 等发现反转录酶以来,此法已广泛应用于人[8]、猪、田鼠、鸭子。
当获得了基因组文库或cDNA文库，可以根据已知的信息合成特异性探针，采用核酸分子杂交的方法从文库中筛选感兴趣的基因片段，这仍是目前获得新基因的一种常用手段。
1.3 化学合成法制备基因片段采用DNA合成仪，对目的基因进行分段合成，然后进行连接，可以得到所需的目的基因。
化学合成法可以改变原始的基因序列，甚至可以合成自然界不存在的序列。
在合成过程中可以根据需要改变核苷酸的密码子，如将真核基因序列中不易在E. coli中利用的稀有密码子改成E. coli偏爱的密码子，有利于真核基因在E. coli中的表达。
2. 重组质粒的构建DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以便下一步转化之用。
这种由两种不同DNA片段重新组合而成的DNA称重组DNA，简称重组体。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连2接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连[10]。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。