双酶切体系
双酶切实验
双酶切概述双酶切反应(Double Digests)1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“se q”标注。
[编辑本段]双酶切的注意事项1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
双酶切鉴定
四、双酶切鉴定㈠双酶切反应(Double Digests)1、同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法。
选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。
NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。
能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。
由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
2、分步酶切如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。
分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。
在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。
这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。
由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。
通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。
BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。
可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。
上表中这些组合以“seq”标注。
㈡连接反应1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
基因克隆技巧之---双酶切系统的具体应用实例
双酶切系统(DDDesigner)的具体应用实例DDDesigner group1. 避免浪费限制性内切酶双酶切系统能够避免限制性内切酶的浪费，因为很多限制性内切酶在实际应用中所需的用量极少。
如：利用NEB公司的PstI-HF和EcoRV-HF两种酶消化长度为3000bp的1ug质粒DNA，当这两种酶在质粒上各只有一个切点时，完全消化质粒DNA所需要的PstI-HF仅为1.2U，需要的EcoRV-HF也仅为1.5U。
由此可见，如果按照该酶所附的使用说明用1ul酶（10或者20IU）消化1ug质粒DNA，你将浪费了大约5-10倍的酶。
这种浪费在一些特别贵的酶上面可能体现得更明显。
2.确保质粒载体的完全酶切，降低载体自连而出现的背景克隆由于单位定义时底物选择的不同，以及酶在底物上识别位点的数目的差别，导致在实际工作中，切割相同的质粒DNA时，不同的酶所需要的酶量（单位数）有很大的差别，有时能够相差近30倍。
如：利用NEB公司的PstI-HF和NheI-HF两种酶消化长度为3000bp的1ug质粒DNA，当这两种酶在质粒上各只有一个切点时，完全消化质粒DNA所需要的PstI-HF仅为1.2U，需要的NheI-HF则高达32U，两种酶的用量相差近30倍。
因而，如果按照该酶所附的使用说明用1ul酶（10或者20IU）消化1ug质粒DNA，那么PstI-HF会出现浪费，但同时，NheI-HF的用量则不能保证质粒DNA的完全酶切。
此种情况下，在进行载体和外源片段的连接时，就会出现大量的载体自连，导致阳性克隆率低，或者克隆失败。
3.确保PCR产物的完全酶切，提高克隆成功率对同样质量(如1ug)的不同DNA样品，长度短（分子量小）的DNA样品中的分子数多，因而如果这些DNA样品分子上的酶切位点数是一样的，那么完全消化较短的DNA分子所需要的酶量将会比完全酶切较大的质粒DNA多。
如：用Takara的EcoRI和XbaI完全酶切1ug纯化的短PCR产物（300bp），且此两种酶在该分子上各有一个识别位点，那么需要大约64U的EcoRI和323U的XbaI。
目的基因双酶切
目的基因双酶切
目的基因双酶切用两个限制性内切酶，质粒上就产生了两个缺口，环状质粒就变成两段线状DNA了。
回收你需要的那一段，因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末端（当然目的基因也要用这两种酶切才行），在T4DNA连接酶在作用下，它们就连到一起了。
注意事项：1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
铺板前后注意用吹风机吹干。
3、对照的设立:为验证双酶切是否成功，可做如下对照:酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。
双酶切的优点是避免目的基因与质粒自环以及目的基因的反向连接。
双酶切的优点乎前是：防止目的基因（载体）自身连接，防止目的基因与运载体反向连接（任意桐团两点）检测目的基因是否表达出岁轮清产物，采用抗原一抗体杂交；从基因组文库获取的。
质粒双酶切构建经验！
质粒双酶切构建经验！大神教你做酶切！1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
双酶切体系
Double Digestion（双酶切反应）时Universal Buffer（通用缓冲液）的使用表
■说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应（Double Digestion）时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统, 并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion 时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer 之前表示的［数字刃是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5 x
时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1X时稀释至10倍，2X时稀释至5倍进行使用。
■注意
◊1 （i g DNA中添加10 U的限制酶，在50 口的反应体系中，37 C下反应1小时可以完全降解DNA。
◊为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◊根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生
Double Digestion不能顺利进行的可。
《双酶切及连接》课件
• 双酶切技术简介 • 双酶切的实验步骤 • 双酶切的应用 • 双酶切的注意事项 • 双酶切技术的发展趋势
01
双酶切技术简介
酶切技术的定义
01
02
03
酶切技术定义
酶切技术是一种利用酶的 专一性对特定底物进行切 割的生物技术。
酶的专一性
酶只对特定的底物起作用 ，切割位点具有高度专一 性。
双酶切技术的改进与创新
新型限制性核酸内切酶的 开发
随着生物技术的不断发展，新型限制性核酸 内切酶不断涌现，为双酶切技术提供更多选 择和灵活性。
自动化双酶切系统的研发
通过自动化技术实现双酶切的快速、高效和 标准化操作，提高实验效率并减少人为误差
。
双酶切技术的发展前景
01
双酶切技术在基因克隆和基因治 疗等领域的应用前景广阔，未来 将继续发挥重要作用。
05
双酶切技术的发展趋势
双酶切与其他技术的结合
双酶切与PCR技术的结合
通过双酶切技术将目的基因和载体进行酶切，再利用PCR技术进行扩增和鉴定，提高基 因克隆的效率和准确性。
双酶切与基因编辑技术的结合
将双酶切技术与CRISPR-Cas9等基因编辑技术结合，实现对特定基因的敲除、敲入和 定点突变等操作，为基因功能研究和基因治疗提供有力工具。
02
随着生物技术的不断进步，双酶 切技术将与其他技术不断融合创 新，为生命科学研究提供更多有 力工具。
THANKS
感谢观看
酶切技术的分类
单酶切技术
使用一种限制性内切核酸酶对 DNA进行切割。
双酶切技术
使用两种不同的限制性内切核酸酶 对DNA进行切割，通常用于产生 具有不同黏性末端的DNA片段， 便于后续的连接反应。
酶切和连接
双酶切：载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。
我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。
我的酶切体系如下：质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng）(NEBlack Eye SfiⅠ1ul(NEBlack Eye BssHⅡ1ul10×buf 2.2ul100×BSA 0.2ul水14.8ul总体积20ul50度，2小时。
切出了370bp左右的片段，回收载体。
然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。
证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。
50度3小时我试过，但是质粒有降解。
酶量应该说是过量的。
请问有什么办法可以酶切完全？粘性连接（一）外源DNA和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。
如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。
但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。
在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。
相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。
实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。
这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。
ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。
不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。
现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。
在瓜作用的底物。
如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。
双酶切的作用
双酶切（Double digestion）是在分子生物学实验中使用两种限制性内切酶（restriction enzyme）同时切割DNA分子的方法。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并在该序列上切割DNA的酶。
双酶切的作用主要有以下几个方面：
DNA片段的定位：通过使用两种限制性内切酶，可以在DNA分子上产生多个切割位点，从而将DNA分子切割成多个特定长度的片段。
这些片段的长度和位置是事先设计和选择的，可以用于定位和标记DNA序列的特定区域。
DNA重组：双酶切可以产生具有相同切割位点的DNA片段，这些片段可以通过DNA重组技术进行连接。
通过将两个不同DNA分子的相应片段切割并重组，可以构建新的DNA分子，例如重组蛋白表达载体、构建基因库等。
片段分析：通过使用两种限制性内切酶切割DNA，可以产生特定长度的DNA片段。
这些片段可以通过电泳等方法进行分离和分析，以研究DNA序列、基因的结构和功能等。
DNA克隆：在分子克隆中，双酶切可以用于将目标DNA片段插入到载体DNA分子中。
通过选择合适的限制性内切酶，可以在载体DNA和目标DNA的特定位置上切割，然后使用连接酶将它们连接起来，形成重组DNA分子。
双酶切在分子生物学研究和基因工程中起着重要作用，它可以用于定位和标记DNA序列、进行DNA重组、分析DNA片段和实现DNA克隆等应用。
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点双酶切：1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。
因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。
有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。
2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。
3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。
酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。
4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。
5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。
6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
双酶切
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
DNA的酶切及电泳检测
DNA的酶切及电泳检测酶切体系：酶切应使用0.5ml灭菌炮弹和灭菌枪头（一般为10ul，也可以适当增加体系量）10ul体系：①DNA含量在0.5ug；②一般酶用0.25ul（理论上1ug DNA~1U ase，实际上，为了便于完全切割，常用1ugDNA~2-4U ase；一般1ul ase为10U, 按此计算）；③buffer 1×用1ul，0.5×用0.5ul（有时会用到1×BSA）；④最后用水补齐。
在配置相同的酶切体系时，可以先总配再分装。
不同的酶有不同的特性，我们平常使用的酶一般为37℃，1h。
双酶切体系：①若两个酶用同一种buffer（须为同一家公司），可一起酶切，至少1h。
②若两个酶不同buffer，最好分开切。
注意：●酶程太大，>100ug/ng DNA或PH>8.0，会导致星活性。
●BSA，牛血清白蛋白。
●Pr, EDTA, 酚，氯仿，SDS, 乙醇都会影响酶活。
可以通过纯化，增加酶量，增加酶切的时间等克服。
配胶：一般配置1%，20ml的琼脂糖凝胶。
0.2g琼脂糖+20ml TAE/TBE→min火（比小火还小两个点）加热2-3min液体至透明→晾至55℃（不烫手即可）→加入0.5ul EB（小分子插入DNA中，紫外显红色，积累性致癌物）→倒入叉好梳子的板内→待胶冷却凝固电泳：每个体系加入10%（1ul）的溴酚兰，混合后点入点样孔中→每块胶中点入合适的marker 以确定每个样品DNA的大小（一般10ul的marker亮度即为0.5ug DNA亮度）→80V 20min 左右溴酚兰跑到全胶的4/5左右。
（溴酚兰所处位置约为400bp）。
实验5质粒DNA的双酶切
3. 凝胶成像系统记录结果（电泳图）
［注定事项］ 1．分子克隆是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量
都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。 2．要注意酶切时加样的次序，一般次序为水、缓冲液、DNA各
通过本实验掌握质粒DNA双酶切的 原理和操作方法
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二、实验原理
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限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序
列的DNA水解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个 核苷酸组成的特定序列
寄主控制的限制与修饰现象
多种细菌能合成限制性内切酶，这是它们保护自己，降 解外来DNA分子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序 列上的A或C碱基的甲基化而不被限制性内切酶攻击，而外 源DNA一旦进入细胞则立即被识别，双股DNA螺旋都被切断。 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核 酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶 限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
平头末端：Ⅱ型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割
双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT’|ATC …… 3’ 3’…… CTA’|TAG …… 5’ 切割后形成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶 连接起来
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影响限制性内切酶活性的因素
• DNA的纯度 • DNA的甲基化程度 • 酶切消化反应的温度 • DNA的分子结构 • 溶液中离子浓度及种类 • 缓冲液的pH值
agacc切割位点距特异性位点至少位于特异性位点距特异性位点序列特异性切割不是在dna克隆中的用途无用十分有用有用型限制性内切酶型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序并在识别点附近的一些核苷酸上切割dna分子中的双链但是切割的核苷酸顺序没有专一性是随机的
双酶切连接全攻略
双酶切连接全攻略一、背景知识1.DNA序列：DNA是生物体中的遗传物质，它由四种碱基（腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)）组成的序列。
DNA的信息是以碱基的顺序编码的，其中两条互补的DNA链可以通过碱基配对形成双螺旋结构。
2.酶切：酶是一类能够催化特定化学反应的蛋白质，酶切是指通过酶的作用，将DNA序列切割成特定的片段。
3.限制性内切酶：也称为限制酶，是一类具有特异性的酶，可以识别并切割特定的DNA序列。
每种限制酶都有自己的切割位点，当DNA序列中出现与其切割位点相匹配的序列时，限制酶将在该位点切割DNA。
二、原理三、步骤1.设计引物：根据需要连接的两段DNA序列，设计引物使其能够加在两端。
引物可以通过计算机辅助设计软件进行设计，同时要确保引物与DNA序列的互补性和合适的长度。
2.DNA提取：从细胞中提取目标DNA序列，可以使用常见的DNA提取试剂盒或其他方法进行提取。
3.PCR扩增：使用引物对DNA进行PCR扩增，产生需要连接的两段DNA序列。
4.DNA酶切：根据已设计的引物，使用限制酶切割两段DNA序列。
注意选择限制酶与引物切割位点相互匹配的酶。
5.酶切后处理：将切割后的DNA片段进行凝胶电泳，用紫外线照射后可见DNA条带。
根据所需片段的大小，选择合适的片段进行提取。
6.连接反应：将两段DNA片段的黏性末端连接在一起。
可以使用商业化的连接试剂盒，也可以自行设计反应体系。
7.改造端：将连接后的DNA进行磷酸化和去磷酸化处理，加入连接酶，使连接更加稳定。
8.转化：将连接后的DNA转化到适当的宿主细胞中，例如大肠杆菌等。
9.鉴定：通过PCR扩增或其他方法对转化细胞进行检验，确认连接是否成功。
注意事项：1.引物设计要合理：引物的长度一般为18-25个碱基，其中含有5'末端的限制酶切割位点。
引物之间应避免互相重叠或互相穿插。
2.限制酶选择要合适：根据所需连接的DNA序列，选择适合的限制酶，并确保其切割位点不会干扰彼此。
各种酶切体系
－
2
6
2.4
10×buffer D
2
1
1
1
3
4
BSA(10µg/µl)
0.2
0.1
0.1
0.2
0.6
0.6
DNA(1µg/µl)
8.3
4
7.9
6
18
30
Not I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
0.4
1.2
1.5
Sal I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
0.4
1.2
1.5
反应条件
37℃，1~3hr，电泳检测
NheI单酶切
依DNA量定体系
20µl
10µl
灭菌去离子水
-
-
10×buffer
2
1
DNA(1µg/µl)
17
8.5
Nhe I
1
0.5
反应条件
37℃，1~3hr，电泳检测
Xbal I和Sal I双酶切体系鉴定
依DNA量定体系
20µl
10µl
10µl
灭菌去离子水
8.5
4.3
－
10×buffer
2
1
1
BSA(10µg/µl)
0.2
0.1
0.1
DNA(1µg/µl)
8.3
4
7.9
Xba I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
Sal I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
反应条件
EcoR I酶切鉴定
组分
体系
质粒DNA
载体双酶切
载体双酶切载体双酶切引言：遗传工程技术的发展给生物学研究带来了一系列的新方法和新工具，其中双酶切技术就是其中之一。
双酶切技术是利用限制性内切酶的作用原理，将目标DNA分子切割成多个片段，并且每个片段分别由两个酶切位点限制性内切酶切割。
这种技术被广泛应用于DNA分子的结构分析、基因组测序、DNA重组等多个领域。
本文将详细介绍载体双酶切技术的原理、应用及其开展的挑战与前景。
一、双酶切技术的原理1.1 限制性内切酶的作用原理限制性内切酶是一类存在于细菌和古菌中的酶，能够识别DNA分子上特定的序列，并且在这些序列之间切割DNA链。
限制性内切酶的识别序列通常是4-8个碱基对长，且具有对称性，也就是说，在一根链上的序列与另一根链上的序列相同。
限制性内切酶可以将DNA链切割为两个或多个碎片，切割的位点可以是在识别序列之间的特定位置，也可以是识别序列内部的特定位置。
1.2 双酶切技术的原理双酶切技术是利用两个限制性内切酶共同作用于目标DNA分子，将其切割成多个特定的片段。
这两个内切酶在DNA上的切割位点不重叠，从而使目标DNA分子被切割成一个或多个特定长度的片段。
由于两个内切酶切割位点之间的序列具有一定长度，所以双酶切片段的长度是可以控制的。
通过选择不同的限制性内切酶组合，可以得到不同长度的DNA片段，从而达到对目标DNA的准确切割。
二、双酶切技术的应用2.1 DNA分子的结构分析双酶切技术作为一种高效的DNA切割方法，被广泛应用于DNA分子的结构分析中。
通过对目标DNA分子进行双酶切，可以将其切割成多个特定长度的片段。
这些片段可以通过电泳分离，并且可以根据片段的长度顺序排列，从而得到目标DNA分子的结构信息。
此外，双酶切技术还可以用于分析DNA序列中的限制性内切酶位点分布情况，从而揭示DNA序列的特点和功能。
2.2 基因组测序基因组测序是生物学研究的重要手段之一，而双酶切技术在基因组测序中起到了关键作用。
在基因组测序的过程中，需要将基因组DNA分子切割成多个小片段，并且每个小片段都需要标记上特定的序列以便后续的测序反应。
双酶切体系定量计算设计查询软件使 用手册
双酶切体系定量计算设计查询软件使用手册Version:1.0目录一、引言 (3)二、软件概述 (3)1. 产品介绍 (3)2. 产品特点 (3)3.产品功能 (3)酶量定量计算 (3)酶切体系缓冲液智能推荐 (3)酶信息数据库查询 (4)三、运行环境 (4)1) 硬件环境 (4)2) 软件环境 (4)四、安装与卸载 (4)五、软件使用说明 (4)1. 登陆 (4)变更语言 (5)修改密码 (6)2. 双酶切设计 (6)第一步，输入底物信息，包括DNA长度，DNA质量 (6)第二步：选择酶供应商 (6)第三步：选择酶切反应所需的酶 (7)3. 设计结果显示 (9)3.1 推荐双酶切设计 (9)3.2 更多信息 (10)4. 酶信息搜索功能 (11)4.1 按照酶名进行搜索 (11)4.2 按照酶识别序列进行搜索 (11)4.3 按照粘性末端进行搜索 (12)4.4 按照同裂酶（同序同切酶）进行搜索 (12)4.5 对异功酶进行搜索 (13)4.6 信息提示 (14)5. 案例帮助教学 (15)6. 反馈功能 (15)7. 英文版 (16)六、版权申明 (16)一、引言编写本使用说明的目的是充分叙述本软件所能实现的功能及其运行环境，以便使用者了解本软件的使用范围和使用方法，并为软件的维护和更新提供必要的信息。
2. 术语和缩写词DDD：Double Digestion Designer双酶切的缩写二、软件概述1. 产品介绍开发团队从实验理论的分子基础出发，结合十多年的分子生物学经验和生物信息学工具，开发了双酶切定量计算设计平台Double Digestion Designer，具有多种应用，操作简易，指导性强等特点，平均可为实验室节省3倍实验支出和时间。
2. 产品特点DDD设计采取B/S架构，由LAMP+JQUERY动态网络构建，核心数据为数据库存取，实时计算结果进行显示。
有以下优点：1. 方便用户。
双酶切和同源重组法构建载体
双酶切和同源重组法构建载体基因克隆是分子生物学中的一种基本的操作方法。
通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方法，这种方法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆。
但是在实际操作中经常会遇到酶切效率及连接效率不高等问题，致使靶基因片段插入载体相当困难，为此人们采取了多种策略进行克隆。
最近开发了一种叫做同源重组的基因克隆方法，相比双酶切载体构建方法，该方法的构建过程有些不同。
首先，靶基因片段扩增引物有别于常规引物设计；其次，载体切割过程中只需要进行单酶切；第三，载体和目的基因片段的连接是基于同源重组而不是粘性末端互补。
载体构建是分子生物研究常用的手段之一，整个过程包括目的基因扩增，载体和目的基因酶切，末端间连接，感受态细胞转化和阳性克隆的筛选，每一个步骤都必须严格控制其反应条件。
一、双酶切构建载体方法双酶切构建载体方法比较繁琐。
首先，对引物的设计有着严格的要求，引物的长度一般为18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游引物之间GC含量不能相差太大，引物中需要加入酶切位点及保护性碱基。
引物设计不当可能在扩增时生成引物二聚体，给实验带来不便。
其次，目的基因有必要进行TA克隆。
在后续的实验操作中，可能会由于酶切效率和连接效率低等原因使得载体构建相当困难，目的基因扩增在这些步骤之前，由于PCR扩增是体外扩增，很容易发生突变，TA克隆有着成功率高的优点，通过TA克隆将目的基因构建进pMD 19T进而转化入大肠杆菌中，单克隆菌体自身的修复机制可保证单一的克隆，利于筛选需要的序列，通过后续测序鉴定可以得到大量正确的目的基因片段，而且直接将PCR产物切下来不易产生粘性末端，连接入表达载体比较困难，通过TA克隆酶切的目的片段产生粘性末端的概率很高。
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Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表
■ 说明
使用二种酶同时进行DNA切断反应(Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。
TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。
尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。
本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。
在本表中，各Universal Buffer 之前表示的[数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。
TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。
终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。
■ 注意
◇1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。
◇为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。
◇根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可
能。