稳定转染细胞系的一般建立方法
稳定细胞系建立学习
置于 ３ ７℃、 ５ ％Ｃ Ｏ 当孔内贴壁细 ２ 的孵箱中培养过夜， 胞达到 ９ ０ ％～ ９ ５ ％时进行转染。在加入脂质体包被的 Ｄ Ｎ Ａ前 ２ｈ ， ６孔板中细胞培养液换为无血清培养基继 ｅ ｐ Ｇ ２细胞孵育期间， 用ｐ Ｈ７ ． ２ 续培养。在待转染的 Ｈ 的Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 分别将 ４μ ｇ 的ｐ Ｃ Ｉ ｎ ｅ ｏ ｍ ｄ ｒ １和 １ ０ ｌ 的脂质 ? ? μ 体（ ｌ ｉ ｐ ｏ ｆ ｅ ｃ ｔ ａ ｍ ｉ ｎ ｅ ） 各稀释至 ２ ５ ０ ｌ ， 轻柔混合后， 室温下 μ
［ ３ ］
， 同时， 首次发现胰
［ ４ ］
ｄ ｒ １ ／ Ｐ ｇ ｐ 表达增高 岛素抵抗的肝癌细胞 ｍ ?
。藉此， 本
研究将携带人类全长 ｍ ｄ ｒ １ｃ Ｄ Ｎ Ａ重组表达质粒 ｐ Ｃ Ｉ ? ｎ ｅ ｏ ｍ ｄ ｒ １转入人肝癌 Ｈ ｅ ｐ Ｇ ２细胞， 成功地筛选出高效、 ? ｅ ｐ Ｇ ２ ／ ｍ ｄ ｒ １ ， 稳定且耐药机理明确的多药耐药细胞株 Ｈ 并测定了其生长曲线、 ｍ ｄ ｒ １ｍ Ｒ Ｎ Ａ和 Ｐ ｇ ｐ 的表达及 Ｐ ? ? ｇ ｐ 的功能等生物学特性， 为进一步研究肝癌细胞耐药 ｇ ｐ的关 机制及其逆转， 以及肝癌细胞胰岛素抵抗与 Ｐ ? 系提供理想的细胞模型。
１ 材料与方法
１ ． １ 材 料 １ ． １ ． １ 重组质粒与细胞 人肝癌细胞株 Ｈ ｅ ｐ Ｇ ２细胞 由兰州大学医学实验中心保存， 携带有人类全长 ｍ ｄ ｒ １ Ｃ Ｉ ｎ ｅ ｏ ｍ ｄ ｒ １由四川大学医学中心 ｃ Ｄ Ｎ Ａ的重组质粒 ｐ ? ? 构建和惠赠。 １ ． １ ． ２ 试剂 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｆ ｅ ｃ ｔ Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎＲ ｅ ａ ｇ ｅ ｎ ｔ 、 质粒提取 ２ ３ （ Ｒ ｈ １ ２ ３ ） 、 低糖 试剂盒购自北京天根公司； 罗丹明 １ Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培养 基 购 自 Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ公 司； 阿霉素（ Ａ ｄ ｒ ｉ ａ ｍ ｙ ｃ ｉ ｎ ，
细胞转染经验
转染注意因素有血清时的转染血清一度曾被认为会降低转染效率，但只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。
转染过程在两步中需要使用培养基做为稀释液：在DNA-阳离子脂质体复合物准备过程以及复合物同细胞接触过程。
在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。
但在复合物形成后，在加入细胞中前可以加入血清。
阳离子脂质体和DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。
对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEMⅠ培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。
对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。
培养基中的抗生素抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。
这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。
这降低了细胞的活性，导致转染效率低。
所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
这样，在转染前也不必润洗细胞。
对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。
另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。
细胞维护和培养的演变可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。
每周传代一到两次，稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。
不要使细胞保持融合超过24小时。
大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。
细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。
这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。
稳定转染细胞株（系）详细构建流程
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
稳定细胞系的构建
二、转染
转染试剂初定为LipofectamineTM 2000 1、转染前24 h，消化牛乳腺上皮细胞并计数，以1X104个细 胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80%— 90%的融合。 2、转染前2h，更换新鲜的1640培养基(10% FBS，无双抗)。 3、用1640培养液(无FBS，无双抗)分别稀释2uL,4uL,6 uL,8uL质粒至体积为50uL，质粒浓度达到0.01ug/uL-0.04 ug/uL,轻轻混匀，室温作用5 min。 4、用1640培养液(无FBS，无双抗)稀释4份Lipofectamine 2000 4 uL至体积为50 uL，轻轻混匀，室温作用5 min 。
5、分别混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此 时单份体积为100 uL，质粒DNA跟转染试剂比分别为（1:2， 1:1，1.5:1，2:1ug/ul）轻轻混匀，室温作用20 min。 6、将12孔板中的旧培养液吸出，用1640培养液 (无FBS） 洗两次，加入400ul1640 (无FBS） 培养液。 7、逐滴加入脂质体/DNA混合物到不同孔中，边加边前后来 回摇动培养板，轻轻混匀。同时设立未转染（500uL无 FBS1640培养液）和转染空白载体对照（4uL Lipofectamine 2000+496uL无FBS1640培养液）。 8、在细胞培养箱中孵育6 h，弃去培养液，加入1640培养液 (10%FBS) 培养48小时。
稳定细胞系的构建
一、筛选药物浓度的测定
1、G418的配制： 1gG418溶入1mlPBS中，再双蒸水到7ml，制成1mg/ml 浓度，过滤保存。 2、筛选浓度测定： 取24孔板接种细胞，待细胞长至汇合度80%~90%时吸取 培养基，PBS洗涤后加入筛选培养基。 筛选培养基G418的浓度梯度为0，200，300，400，500， 600，700，800，900，1000ug/ml，每浓度两孔，根据 细胞生长情况2~3天更换一次筛选液。 3、选定10~14天细胞全部死亡的最小浓度为筛选浓度，一半 浓度为维持浓度。
shRNA沉默CBS基因的慢病毒载体构建及稳定转染PC12细胞系的建立
shRNA沉默CBS基因的慢病毒载体构建及稳定转染PC12细胞系的建立尹涵予;廖志强;尹蔚兰【摘要】目的：硫化氢是一种重要的气体信号分子，作为一种神经调质在神经系统中起重要作用。
胱硫醚-β-合成酶（CBS）是脑内硫化氢合成的主要酶。
构建针对大鼠 CBS 基因的 shRNA 干扰载体，稳定转染 PC12细胞，观察该载体对PC12细胞CBS 基因的沉默效应。
方法：构建三条针对大鼠CBS 基因的shRNA，经前期实验筛序一条最有效靶点与载体 GV248（hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin）连接，经转化及 PCR 阳性克隆筛选及测序鉴定。
将 LV-CBS-ShRNA 慢病毒载体连同包装载体经脂质体2000共转染到293T 细胞，慢病毒包装后用荧光法进行滴度测定。
将包装好的慢病毒转染到 PC12细胞，用嘌呤霉素进行筛选，得到稳定转染 LV-CBS ShRNA的 PC12细胞。
实时荧光定量 PCR 检测CBSmRNA 的表达，Western-blot 检测 CBS 蛋白的表达。
结果：PCR 扩增和测序结果证明，成功构建大鼠 LV-CBS ShRNA 慢病毒载体，经包装产生的慢病毒滴度为1×109 TU ／mL。
与转染阴性对照慢病毒（LV-NC-ShRNA）的细胞比较，LV-CBS ShRNA 慢病毒转染可使 PC12的 CBSmRNA 和 CBS 蛋白表达分别下降51．2％和48％。
成功构建 CBS 基因 ShRNA 干扰的 PC12细胞株，为后续研究CBS 在神经系统中的作用奠定基础。
%Objective:Hydrogen sulfide gas is an important signaling molecule.As a neuromodulator,it plays an impor-tant role in the nervous system.Cystathionine-beta-synthase (CBS)is the main synthesis enzyme of hydrogen sulfide in the brain.To construct the lentivirus with shRNA interference vector for CBS gene by RNA interference technology,lenti-virus was packaged,then transduced intoPC12 cells.Method:Three shRNA sequences targeting CBS gene were de-signed and synthesized,and the best one was cloned into GV248 (hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)vector to construct the lentiviral expression vector containing CBS ShRNA (LV-CBS-ShRNA).Positive clones confirmed by PCR and DNA sequencing.Subsequently LV-CBS-ShRNA and packing plasmids were contransfected into 293T cells by Lipofectamin 2000.The titer of virus was detected according to the expression of enhanced green fluoreseen protein (EGEP).The packaged lentivirus transfected into PC12 cells were filtered with puromycin,then the PC12 cells with CBS ShRNA transfected were constructed.Real-time PCR detected the expression of CBS mRNA.Western-blot detected the expression of protein CBS.Results:PCR analysis and DNA sequencing proved that LV-CBS-ShRNA was constructed successfuly.The lentivirus titer is,1 ×109 TU /pared with negative control lentivirus(LV-NC ShRNA)the level of CBS mRNA and CBS protein in LV-CBS-ShRNA decreased 51.2% and 48% respectively.Conclusion:PC12 cells with CBS ShRNA strain was successfully constructed by using lentiviral vector,and provided a stable cell lines to study the effect of H2 S on nervous system.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2016(025)005【总页数】5页(P451-455)【关键词】RNA干扰;PC12;胱硫醚-β-合成酶;转染;慢病毒【作者】尹涵予;廖志强;尹蔚兰【作者单位】湖南省衡阳市第八中学，湖南衡阳 421008;南华大学医学院临床医学系，湖南衡阳 421001;南华大学医学院生理学教研室 /神经生物学研究所，湖南衡阳 421001【正文语种】中文【中图分类】Q78;R318H2S 是近年来发现的被称为第三种气体信号分子[1-2]，它的作用仅次于CO和NO，在人体内广泛发挥作用。
稳转细胞系构建流程
稳转细胞系构建流程英文回答：Stable cell line generation workflow.Stable cell line generation is a crucial technique in cell biology and biotechnology. It involves introducing genetic material into a host cell to create a cell linethat stably expresses the desired gene product. This approach allows for the production of therapeutic proteins, industrial enzymes, and other valuable products.The workflow for stable cell line generation typically includes the following steps:1. Plasmid construction: The gene of interest is cloned into an expression vector, which contains elements necessary for gene expression, such as a promoter, transcription termination signal, and selection marker.2. Transfection or transduction: The expression vectoris introduced into the host cell using a variety of methods, including transfection with chemical reagents or electroporation and transduction with viral vectors.3. Selection: Cells that successfully take up and express the expression vector are selected using a suitable selection marker, such as antibiotic resistance or fluorescence.4. Clonal expansion: Individual cells are isolated and expanded to establish clonal cell lines.5. Characterization: Clonal cell lines arecharacterized for their expression levels, stability, and other relevant properties to identify those with thedesired characteristics.Stable cell lines are essential tools for basic research, drug discovery, and industrial biotechnology.They offer several advantages over transient expression systems, including sustained and high-level production ofthe desired gene product, genetic stability, andscalability for large-scale production.中文回答：稳转细胞系构建流程。
稳转细胞系构建方法总结
稳转细胞系构建方法总结
稳定细胞系构建是生物学研究中非常重要的一部分，它可以用
于基因功能研究、药物筛选、疾病模型构建等多个领域。
稳定细胞
系的构建方法有多种，下面我将从多个角度对稳定细胞系构建方法
进行总结。
首先，稳定细胞系构建的关键步骤包括转染、筛选和鉴定。
转
染是将外源基因导入目标细胞中的过程，常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒载体法。
化学法包括钙磷沉淀法和脂质体转染法，电穿孔法则利用电脉冲使细胞膜通透性增加，病毒载体法则利
用病毒作为基因导入的载体。
转染后，需要进行筛选以筛选出含有
外源基因的稳定细胞系，通常使用抗生素筛选或者荧光蛋白标记等
方法。
最后，对所得到的细胞系进行鉴定，确认其是否稳定表达外
源基因。
其次，稳定细胞系构建的选择合适的细胞系也是非常重要的。
常用的细胞系包括HEK293、CHO、Hela等，选择合适的细胞系可以
影响到后续的稳定细胞系构建和应用效果。
另外，稳定细胞系构建方法还需要考虑外源基因的选择和构建。
外源基因可以是编码蛋白质的基因、RNA干扰基因、CRISPR-Cas9系统等，根据研究的需要选择合适的外源基因进行构建。
此外，稳定细胞系构建的过程中还需要考虑细胞毒性、稳定性和表达水平等因素，以确保所得到的稳定细胞系能够稳定、高效地表达外源基因。
总的来说，稳定细胞系构建是一个复杂的过程，需要综合考虑转染方法、细胞系选择、外源基因选择和构建以及细胞系鉴定等多个因素，才能够成功地构建稳定细胞系。
希望以上总结能够对你有所帮助。
用G418建立稳定细胞系
实验步骤1
1. 转染：
用CHO或者N2a细胞转染BACE-HA后培养48小时，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；
2. 加G418:
去掉培养液，PBS洗一次，加入浓度为800ug/ml的G418筛选培养基。
3. 换液：
根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。
筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；
4. 挑单克隆：
制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/5ul。
在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液5ul/孔。
待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。
5. 单克隆鉴定：
细胞大量扩增后，同时用原细胞系转染PCDNA3.1,并设置对照组即空白对照，提蛋白，做western blot检测。
实验步骤2
1. 将处于对数生长期的CHO或者N2a细胞按比例接种于12孔板，待细胞长到60%时转染。
转染方法同瞬时转染。
2. 待24-48小时后换为含800ug/mlG418的选择性培养基，将细胞按1:10稀释后稳定培养两周换为含600ug/mlG418的选择培养基
3. 将混合细胞吹打成单细胞悬浮计数，调整细胞数为每孔20个/孔，加入100ul含200ug/mlG418的选择培养基，待抗性克隆长出后挑选良好的克隆，逐步放大，压力由含200ug/mlG418的培养基增加至含800ug/mlG418的培养基继续筛选，最后稳定用含800ug/mlG418培养基培养。
稳转细胞系构建简单原理_概述说明以及解释
稳转细胞系构建简单原理概述说明以及解释1. 引言1.1 概述在细胞生物学和遗传学领域，稳转细胞系构建是一项重要的技术，用于研究基因表达、蛋白质功能以及疾病的发生机制等。
稳转细胞系构建是指将外源基因或RNA序列引入目标细胞系中，并使其表达并稳定地传递给后代细胞。
这项技术为科学家们提供了一个探索和理解生命活动的重要工具。
1.2 文章结构本文将分为五个部分进行阐述。
首先，在引言部分对稳转细胞系构建进行概述和解释，介绍文章主要内容。
第二部分将详细介绍稳转细胞系构建的基本概念以及常用的方法。
接着，第三和第四部分将侧重于讨论关键要点一和关键要点二，并解释其原理、提供示例或案例分析，并对应用场景进行分析。
最后，在结论与展望部分，将对已述内容进行总结，并提出对未来发展的展望或建议。
1.3 目的本文的目的是向读者介绍稳转细胞系构建的简单原理，包括基本概念、构建方法和原理解释。
同时，通过讨论关键要点一和关键要点二的实例和案例分析，以及对其应用场景的分析，帮助读者更好地理解该技术在科学研究中的意义与应用。
通过本文的阅读，读者将能够对稳转细胞系构建有一个全面且清晰的认识，并为未来相关研究提供参考依据。
2. 稳转细胞系构建简单原理2.1 基本概念解释稳转细胞系是指通过基因转染或基因编辑技术，使得一种细胞在经过多代分裂之后，其特定基因的表达能够被持续稳定地维持。
这样的细胞系在科学研究和生物制药领域中具有重要的应用价值。
2.2 稳转细胞系构建方法构建稳转细胞系的方法主要包括基因转染、基因编辑和选择标记等步骤。
a) 基因转染：常见的基因转染方法包括质粒DNA介导的转染、病毒载体介导的转染以及利用脂质体或者聚合物等载体传递外源基因到目标细胞中。
b) 基因编辑：目前常用的基因编辑技术为CRISPR-Cas9系统，通过引入Cas9核酸酶和相应的寻找序列（sgRNA），实现对目标基因组进行特异性剪切、插入或敲除等修饰。
这种方法可以直接修改目标细胞内特定基因座位，从而实现特定功能蛋白的表达。
细胞稳转细胞系构建
细胞稳转细胞系构建1. 引言细胞系是指从原始组织中获得的、可以无限增殖并保持某种特定功能的细胞群体。
细胞系的构建对于生物医学研究、药物开发等领域具有重要意义。
然而，由于细胞的特性和环境的变化，细胞系的构建并不容易稳定和持久。
本文将介绍一种细胞稳转细胞系构建的方法，旨在提供一种可靠的方法来构建稳定的细胞系。
2. 细胞稳转细胞系构建的原理细胞稳转细胞系构建的原理是通过引入稳定的转染系统，将目标基因稳定地表达在细胞中。
这样一来，细胞系就能够维持目标基因的表达，从而实现稳定的细胞系构建。
具体而言，细胞稳转细胞系构建的步骤如下：2.1 选择合适的转染系统选择合适的转染系统是细胞稳转细胞系构建的第一步。
常用的转染系统包括病毒载体、质粒转染和基因编辑技术等。
根据不同的实验需求和细胞类型，选择适合的转染系统。
2.2 构建稳定的转染载体构建稳定的转染载体是细胞稳转细胞系构建的关键步骤之一。
转染载体应包含目标基因的全长序列，并且能够在细胞中稳定表达。
同时，转染载体还应包含选择性标记基因，以便筛选出稳定转染的细胞。
2.3 转染细胞将构建好的转染载体导入目标细胞中，使其发生转染。
转染可以通过多种方法实现，如化学转染、电穿孔法和病毒介导转染等。
选择合适的转染方法，确保转染效率和细胞存活率。
2.4 筛选稳定转染细胞在转染后，使用选择性培养基或药物筛选出稳定转染的细胞。
选择性培养基或药物应选择适合目标基因的表达和细胞存活的浓度。
筛选出的稳定转染细胞即为构建的细胞系。
3. 实验步骤为了更好地理解细胞稳转细胞系构建的方法，以下是一种常用的实验步骤：3.1 选择合适的转染系统根据实验需求和细胞类型，选择合适的转染系统。
例如，如果需要稳定表达目标基因的细胞系，可以选择质粒转染系统。
3.2 构建稳定的转染载体根据目标基因的全长序列，设计合适的转染载体。
转染载体应包含目标基因的启动子、终止子和选择性标记基因等。
使用分子生物学技术构建稳定的转染载体。
KIF5B-RET慢病毒载体构建及稳转细胞系的建立
KIF5B-RET慢病毒载体构建及稳转细胞系的建立摘要将 KIF5B-RET序列连接到Lenti6.3-eGFP上，重组获得慢病毒载体，包装生产慢病毒并测定其滴度，再将此慢病毒转染肺癌细胞系并筛选验证。
本实验成功构建了KIF5B-RET慢病毒载体，并建立稳定表达KIF5B-RET的肺癌细胞系。
关键词 KIF5B-RET基因；慢病毒载体；肺癌细胞一、引言RET（rearranged during transfection）融合基因是新发现的肺腺癌驱动基因，已成为独立的新的分子亚型[1]。
Cabozantinib等几种市售的多靶点激酶抑制剂均能抑制RET激酶活性[2]，但特异的小分子抑制剂需进一步研究开发。
慢病毒表达载体具有高转染效率，目的基因可整合到宿主细胞基因组中，且长期表达。
本研究通过成功构建KIF5B-RET基因慢病毒载体，建立稳定表达 KIF5B-RET的肺癌细胞系，为药物开发及筛选奠定基础。
二、材料与方法1.材料慢病毒载体 pLenti6.3_MCS（图1）购自Invitrogen公司，KIF5B-RET融合基因质粒由本实验室保存。
293T细胞购自中科院上海细胞库。
限制性内切酶 PacI、AscI、T4 DNA ligase购自NEB公司。
Lipofectamine2000购自 Invitrogen 公司。
质粒提取、胶回收试剂盒购自Biomiga公司。
2. 慢病毒表达载体的构建及鉴定用PacI / AscI把质粒37℃酶切2小时，电泳回收后，用T4 DNA ligase连接回收的片段与载体。
取10ul连接产物转化感受态细胞DH5a。
涂平板挑取单克隆摇菌，质粒中抽试剂盒提取质粒。
3. 病毒包装取 293T细胞按照每个10cm的培养皿6x106个细胞数铺板。
第2天，取9ug PackagingMix和 3ug慢病毒质粒加入1.5ml Opti-MEM混匀。
取36ul lipofectamine2000 加入1.5 ml Opti-MEM中，混匀后将3ml复合物加入到细胞中过夜，换用培养基后培养3 d，收获细胞培养上清，分装，－80℃保存。
shrna稳转细胞株 构建 步骤
shrna稳转细胞株构建步骤
构建shrna稳转细胞株的步骤如下：
1. 设计并合成shrna。
2. 构建包含shrna的表达载体，常用的是慢病毒载体。
3. 包装慢病毒，这一步通常需要借助病毒包装系统完成。
4. 滴度测定，测定病毒滴度是制备稳定转染细胞株的重要步骤。
5. 慢病毒感染，将目的细胞与慢病毒混合培养，使病毒进入细胞并整合到宿主染色体中。
6. 筛选稳定表达细胞株，在感染72小时后开始加入筛选药物，每隔2天重新换液并加入筛选药物。
药物筛选需至少持续14天，直至显微镜下观察到的荧光细胞比例为100%。
7. 鉴定稳转细胞株，对筛选到的稳定表达细胞株进行鉴定，验证其是否稳定表达目的基因。
以上步骤仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。
细胞稳定转染方法
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
稳转细胞系的构建方法
稳转细胞系的构建方法以稳转细胞系的构建方法为标题，写一篇文章细胞系是指从原始组织或细胞中获得的具有相同遗传特征和生物学行为的细胞的连续生长和传代。
稳转细胞系即指在细胞系中稳定表达外源基因的细胞系。
构建稳转细胞系是细胞和分子生物学研究中常用的技术手段之一，它可以为我们研究基因功能和细胞信号传导提供重要的工具。
构建稳转细胞系的方法有很多种，下面将介绍其中的几种常用方法。
1. 转染法转染法是最常见的构建稳转细胞系的方法之一。
它通过将外源基因导入到目标细胞中，使细胞表达该基因。
常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒载体法等。
其中，化学法是最简单和常用的方法之一，它通过利用化学试剂将外源基因导入细胞内。
电穿孔法则是利用电脉冲使细胞膜发生短暂的孔洞，从而导入外源基因。
病毒载体法则是利用病毒作为载体将外源基因导入细胞内。
转染法的优点是操作简单，适用于多种细胞类型，但其缺点是转染效率低，稳定性差。
2. 质粒整合法质粒整合法是构建稳转细胞系的另一种常用方法。
该方法利用特定的质粒将外源基因整合到细胞染色体中，使其稳定表达。
常用的质粒整合方法包括选择性抗生素筛选法和荧光素酶报告基因法等。
选择性抗生素筛选法是将外源基因与抗生素抗性基因连接在一起，然后将其导入细胞中，再通过选择性培养基对细胞进行筛选，只保留表达外源基因的细胞。
荧光素酶报告基因法则是将外源基因与荧光素酶基因连接在一起，然后通过荧光素酶活性检测来筛选表达外源基因的细胞。
质粒整合法的优点是构建的稳转细胞系稳定性较好，但其缺点是构建过程较复杂，适用细胞类型有限。
3. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9技术是一种新兴的基因编辑技术，也可以用于构建稳转细胞系。
该技术利用CRISPR/Cas9系统的导引RNA和Cas9蛋白靶向编辑细胞染色体中的特定位点，使外源基因整合到细胞染色体中。
CRISPR/Cas9技术具有高效、精准和灵活的特点，使得构建稳转细胞系变得更加简单和快速。
稳转细胞系构建-ZXD
稳转细胞构建
构建载体（过表达/干扰） 慢病毒包装
细胞复苏、传代 嘌呤霉素浓度筛选
慢病毒感染 筛选抗性细胞 鉴定及扩大培养
稳转细胞系建
1、载体构建及慢病毒包装（略） 2、细胞复苏及传代 3、确定嘌呤霉素最优筛选浓度：
1）培养待转染（而不是转染后）的细胞。 2）取对数生长期的细胞，用培养基制成细胞密度为1.5×105 个/ml的细胞悬液。 3）96孔培养板每孔加入100ul细胞悬液（使每孔细胞数在1.5×104个），37℃培养箱中培养 过夜。 4）分别加入不同浓度嘌呤霉素，使终浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8μg/ml，每日检查细 胞活力，筛选出最佳浓度。
Thanks！
稳转细胞系筛选实验
简介
稳定转染就是转染的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期 表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高 转染效率的病毒，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进 行细胞传代，从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。 筛选稳定细胞系有两种方法： 1）转染质粒后，筛选获得稳转细胞系； 2）慢病毒感染筛选稳定细胞系。慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法 更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。 应用： 1）基因过表达服务 2）shRNA 干扰服务 3）miRNA过表达 4）任意非编码基因的过表达
简介
为什么要挑选单克隆细胞 多克隆细胞株筛选比较快速，费用较低。 单克隆细胞株筛选周期长，费用高。 多克隆细胞系构建成功后由于不同细胞克隆生长速度不一致，目的基因表达 量比较低的细胞克隆增殖速度一般更快，因此在最初的10代左右会观察到表 达量逐渐下降，最后高表达量低增殖速度的细胞消失，低到中等表达量的细 胞组成稳定表达克隆。 对于转染效率和表达效率低的细胞系，多克隆细胞筛选得到的细胞系中目的 基因的表达量有可能不能满足实验要求。 单克隆细胞系在细胞克隆挑选后可以对目的基因表达量进行检测，挑选出高 表达的细胞克隆进行培养。这一步骤在转染效率低的细胞株中尤其重要。 做细胞亚定位的稳定细胞系，存在表达量过低、荧光信号不够强，以及表达 量过高、荧光蛋白聚集导致不能正确定位两种问题。单克隆细胞系挑选可以 直接选出定位正确的细胞克隆。
稳转细胞系
稳转细胞系介绍稳转细胞系（stable cell line）是在细胞培养中建立的细胞系，经过基因转染或突变处理后表达特定蛋白或具有特定功能。
稳转细胞系的建立对于研究细胞功能和相关疾病的分子机制非常重要，因为稳定表达的细胞系相比于野生型细胞具有更高的表达水平和稳定的遗传特性。
构建稳转细胞系的方法转染转染是构建稳转细胞系的常用方法之一，主要通过将外源基因导入目标细胞中，使其表达目标蛋白。
常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒转染法。
•化学法：通过使用化学物质（如聚乙烯醇）或离子性脂质体来改变细胞膜的通透性，使外源基因进入细胞内。
•电穿孔法：利用高电压脉冲作用于细胞，破坏细胞膜的完整性，从而实现外源基因的导入。
•病毒转染法：利用复制缺陷病毒载体，将外源基因嵌入病毒基因组中，并通过感染细胞来实现基因传递。
选择性筛选转染后，为了得到稳转细胞系，需要进行选择性筛选。
常用的筛选方法包括对细胞进行抗生素或毒素的暴露。
•抗生素选择：将外源基因与抗生素抗性基因相连，转染到细胞中后，只有表达该外源基因的细胞才能存活下来。
•毒素选择：通过将外源基因与毒素敏感基因相连，转染到细胞中后，只有表达该外源基因的细胞能够抵抗毒素的作用。
单细胞分离和扩增经过选择性筛选后，得到稳转细胞系的一个重要步骤是进行单细胞分离和扩增。
这可以通过限稀稀释或使用流式细胞术等方法来实现。
通过单细胞分离，确保每个细胞都是来自同一个克隆细胞，并且能够扩增细胞数量以建立稳定的细胞系。
验证稳定性和功能建立稳转细胞系后，需要对其进行稳定性和功能的验证。
稳定性验证通常通过长期培养和细胞传代来观察外源基因的稳定表达水平；功能验证则通过相关实验和技术手段来验证细胞系是否成功表达目标蛋白或具备特定功能。
应用领域稳转细胞系广泛应用于多个研究领域，尤其是以下几个方面：蛋白表达和纯化稳转细胞系可用于大规模产生和纯化外源蛋白。
通过构建表达外源蛋白的稳转细胞系，可以实现大量高质量的蛋白产生，为蛋白质研究和生物药物生产提供方便。
人PSCA真核表达质粒的构建及稳定转染B16细胞系的建立
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色素瘤 Ｂ ６细胞系。方法 ： １ 利用 Ｐ Ｒ扩增出人 ＰＣ Ｃ Ｓ Ａ全长基 因的 ｅ Ｎ Ｄ Ａ编码 区序列 ， 使用基因重组 技术将其 克隆到真核表达载
体 ｐＤ Ａ ． 中 ， ｃ Ｎ ３ １ 得到重组表达质粒 ｐＤ Ａ ．－Ｓ Ａ ｃ Ｎ ３ １ＰＣ 。双酶切 及测序鉴 定后 ， 利用 脂质体 法将其 转染入 小 鼠黑色素瘤 Ｂ ６细 １
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分பைடு நூலகம் 与细胞 免疫 学 ・
人 ＰＣ Ｓ Ａ真 核 表达 质粒 的构 建 及 稳定 转 染 Ｂ ６细胞 系的建 立① １
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moFcγRⅢ、γ链真核表达载体的构建及其共转染稳定细胞系的建立
实 验 室 ／ 南省 动物 免 疫 学 重 点 实 验 室 ， 南 郑 州 ４ ０ ０ ） 河 河 ５ ０ ２
摘 要 ： ｍｏ ｃ ＲⅢ 、 将 ＦＴ ７链 编 码 区 ｃ ＤＮＡ 分 别 亚 克 隆 到 真 核 表 达 载 体 ｐ Ｄ ｃ ＮＡ３的 巨细 胞 病 毒 启 动 子 下 游 ， 建 了 重 组 表 达 质 粒 ｐ ３ ＲⅢ、 ｃ ｍｏ ； Ｐ ｕＩ线 性 化 重 组 质 粒 ， 线 ４． 组 质 粒 共 构 ｃｍｏ ｐ ３ ｙ 用 ｖ 以 ｝ Ｊ重 ｉｃ 转 染 Ｃ 一７细 胞 ， 玫 瑰 花 环 试 验 检 测 ｍｏ ｃ Ｒ１在 转 染 细 胞 表 面 的 表 达 ， 过 Ｇ １ ＯＳ 用 ＦＴ １ Ｉ 通 ４ ８抗 性 筛 选
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稳定转染细胞系的构建流程
稳定转染细胞系的构建流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立
ｔ Ｓ真核表达载体构 建及稳定转 染 Ｈｅ Ｇ Ｔ ｐ ２细胞 系的建立
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（．广 州 军 区 疾 病 预 防 控 制 中 心 ， 东 广 州 ５ ０ ０ ；２ １ 广 １ ５ ７ ．中 山大 学 实验 动 物 中心 ， 东 广 州 ５ ０ ８ ） 广 １０ ０
经 酶切 和 测序 鉴 定后 ， 脂 质 体 转 染 法 转 染 Ｈｅ Ｇ２细 胞 ， 过 Ｇ４ ８筛 选 ， 立 稳 定 转 染 的 Ｈｅ Ｇ２细 胞 系， ＲＴ－ 用 ｐ 通 １ 建 ｐ 用
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转染克隆的G418筛选和分离
对于需要建立某些基因已经整合到染色体DNA（通过稳定或永久转染）的细胞系来说，理想的是使用选择标记，通常也是必要的。
虽然有许多标记可利用，但G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。
G418是一种氨基糖苷类似物，在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似，它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。
因此在哺乳动物细胞中表达细菌APH（氨基糖苷类磷酸转移酶）基因将产生G418的解毒作用。
这一程序提供了建立G418选择条件的一般性指导，特殊条件由研究者个人决定。
1.建立死亡曲线，确定最佳筛选浓度（参考建立方法见附录）；
2.细胞铺板：转染后24小时将贴壁的细胞传代（传代时，注意通过在显微镜下观察，控
制细胞密度，不能使细胞太密集，应该少于生长表面的50%，参考为20%-30%）至15cm 培养皿，加入15~20ml培养基（DMEM，含血清）进行培养；
3.用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选：铺板完成后，再过24小时，抗性表达，用最
佳筛选浓度的G418进行筛选（对于Hela细胞，一般筛选终浓度为800ug/ml）。
具体操作是去除旧的培养基，用PBS洗一次，将含有浓度为800ug/ml（以Hela为例）的培养基15~20ml加入培养皿内即可；
4.换液：每日及时观察细胞，根据培养基的颜色和细胞生长情况，及时更换相同浓度
（800ug/ml）的培养基，大概持续筛选一周左右，直至空白对照组（未转染组）细胞死亡大部分（至少30%以上）；
5.撤药维持阶段：待空白组细胞大部分死亡后，将实验组（转染组）进行换液，此时所用
培养基含G418的终浓度为200ug/ml（维持浓度），维持生长（若细胞仍有死亡，需要继续降低药的浓度，参考为50-100ug/ml），直至筛选克隆可见为止（大约2~3天）；
6.分离克隆以获得最大数量细胞（提高克隆成活可能性），减少单个克隆受其他细胞污染
的机会。
具体操作是：a.用PBS洗含有克隆的培养物，圈出欲分离的克隆。
从培养皿中除去液体，准备24孔板收集克隆；b.从培养皿中用牙签或者棉棒（经过高压）挑取已分离出的克隆（具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶，再蘸一下克隆）；c.在24孔板的一个孔中（事先已加入完全培养基，不含G418）剧烈摇动牙签，使细胞沉于孔中，继续挑取下一个克隆；
7.CO2孵箱，温育细胞约两小时；
8.两小时后，镜检培养皿，确定细胞是否附着。
如果已经附着，用新鲜完全培养基（含
50ug/ml G418）更换24孔板培养基，除去残留的胰蛋白酶，继续培养直到培养物长满；
9.一旦小量培养物长满，转接到大的培养皿（通常先是6孔板），用50ug/ml的新鲜完全
培养基维持培养，然后与同样类型的其他细胞一样处理即可。
附录：死亡曲线建立方法
1.G418的配制：取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中，加蒸馏水至10ml，过滤
除菌，4℃保存；
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6h
左右开始加药；
3.制备筛选培养基：在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100、400、800、
1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基；
4.加G418筛选：吸除培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基；
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每隔3~5d更换一次筛选培养基；
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10~14d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选
浓度。