高效液相色谱法测定依达拉奉注射液中依达拉奉及有关物质的含量

高效液相色谱法测定依达拉奉注射液中依达拉奉及有关物质的含量目的建立测定依达拉奉注射液中依达拉奉及有关物质含量的高效液相色

谱法（HPLC）。方法采用Cromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢铵溶液（50：50）[用20%磷酸调节pH值至（3.5±0.1）]；流速：1.0 ml/min；检测波长：239 nm；柱温：30℃。结果在该色谱条件下，依达拉奉与样品中杂质可完全分离；在6.024～54.216 μg/ml 范围内，峰面积与其浓度线性关系良好（r = 0.9997，n = 5），平均回收率为100.34%（RSD = 0.55%，n = 9），最低检出量为12.1 ng。结论本法操作简便快速，准确可靠，专属性强，可用于依达拉奉注射液中依达拉奉及有关物质的测定。

标签：依达拉奉；HPLC；含量测定；有关物质

依达拉奉（edaravone，3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮）为强效自由基清除剂，于2001年在日本上市，临床上主要用于治疗急性缺血性脑卒中[1]。作为第1个新型氧自由基清除剂，具有清除自由基、抑制脂质过氧化及减轻缺血脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化和再灌注损伤的作用，并可阻止脑水肿和脑梗死进展，改善因急性脑梗死所致的神经症状、日常生活活动能力和功能障碍[2]。近年来，有关依达拉奉治疗肌萎缩侧索硬化症、帕金森病等的临床研究正在进行中，抗癫痫和抗类风湿性关节炎在临床实践中被发现，其对人类多种疾病的有效性说明此药具有广阔的开发前景[3]。本研究根据依达拉奉的结构特点和化学性质，参考相关文献[4-7]，建立了高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定依达拉奉注射液中依达拉奉及有关物质的含量，本方法能将供试品中主峰与有关物质峰完全分离，且能有效检出依达拉奉注射液中所含杂质，具有专属性强、灵敏度高、选择性好、简便、准确等特点，可有效地应用于依达拉奉注射液的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-15C高效液相色谱仪，SPD-15C紫外-可见光检测器（日本岛津公司），CTO-15C色谱柱柱温箱（日本岛津公司），Lcsolution 15C 工作站（日本岛津公司），SIL-10AF自动进样器（日本岛津公司）；UV-2450紫外分光光度计（日本岛津公司）、AUW120D 岛津分析天平。

1.2 试药

甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。依达拉奉对照品（批号：100620-200401；含量100%，中国药品生物制品检定所）；依达拉奉注射液（福寿堂制药有限公司；规格：20 ml∶30 mg；批号：110911、110913、110915）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和系统适用性试验

色谱柱：Cromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氢铵溶液（50∶50）[用20%磷酸调节pH值至（3.5±0.1）]；流速1.0 ml/min；检测波长：239 nm；柱温：30℃；进样量：20 μl[8-9]。

2.1.1 对照品溶液的制备

取依达拉奉对照品适量，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每毫升中约含30 μg的溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密量取依达拉奉注射液（批号：110911）2.0 ml，置100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。

2.1.3 空白辅料溶液的制备

按处方制备不含依达拉奉的溶液。取空白辅料溶液2.0 ml，置100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。

2.1.4 系统适用性试验

在上述色谱条件下，分别精密吸取空白辅料溶液、依达拉奉对照品溶液及依达拉奉供试品溶液各20 μl进样。理论板数以依达拉奉峰计算应不低于1000。结果提示，理论板数以依达拉奉峰计为2500，空白辅料对测定无干扰（图1）。

2.2 破坏性试验

在杂质或降解产物不能获得的情况下，对本品进行酸、碱、热、光、氧强制降解试验。

2.2.1 样品的制备

2.2.1.1 破坏前样品的制备精密量取110911批次的依达拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.1.2 酸破坏样品的制备精密量取依达拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，加入0.1 mol/L的盐酸溶液2 ml，室温下静置4 h后，加0.1 mol/L的氢氧化钠溶液适量中和，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.1.3 碱破坏样品的制备精密量取110911批次的依达拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，加入0.1 mol/L的氢氧化钠溶液2 ml，室温下静置4 h后，加适

量0.1 mol/L的盐酸溶液中和，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.1.4 热高温破坏样品的制备精密量取110911批次的依达拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，150℃高温加热1 h后取出，放至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.1.5 光照破坏样品的制备精密量取110911批次的依达拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，用流动相稀释至刻度，在强光（4500±500）Lx下放置4 h 后，摇匀，滤过，即得。

2.2.1.6 氧化破坏样品的制备精密量取110911批次的依達拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，加入10%的过氧化氢2 ml，室温放置2 h，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。精密量取上述样品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.2.2 破坏性试验的结果

本品在酸、碱、热条件下较稳定，但是在氧化和光条件下有明显的降解产物生成。本品溶液在酸、碱、氧化、光照及高温条件下进行破坏所产生杂质在本色谱条件下均能与依达拉奉良好分离，因此可以采用上述色谱条件测定本品的有关物质（图2）。

2.3 线性关系考察

取依达拉奉对照品，精密称定，置容量瓶中，加流动相溶解使成约0.3 mg/ml 溶液，作为贮备溶液。分别精密量取上述贮备溶液 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 ml 置入50 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。精密量取上述溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积。以溶液浓度（X）为横坐标，以相应峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，回归方程Y = 151 629X+839 53（r = 0.9997）。结果提示，依达拉奉溶液在6.024～54.216 μg/ml范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.4 检出限

取依达拉奉对照品溶液（0.3 mg/ml），用流动相进行逐级稀释，按“2.1”项下色谱条件进样20 μl，以信噪比为3∶1的进样浓度为最低检出限，依达拉奉溶液的最低检出限为12.1 ng/ml。

2.5 精密度试验

精密量取110911批次的依达拉奉注射液2.0 ml，置100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取上述样品溶液各20 μl，连续测定6次，记录各次测定的主成分峰面积，按峰面积计算，RSD值为0.64%，表明本方法进样精密度良好。