Taqman探针及SYBR Green I荧光染料技术
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半定量RT-PCR原理 原理 半定量
半定量RT-PCR是指通过总 是指通过总RNA逆转录为 逆转录为cDNA后，扩 半定量 是指通过总 逆转录为 后 增目标cDNA和内参 和内参cDNA，通过 增目标 和内参 ，通过PCR产物量推测样品中特 产物量推测样品中特 的相对数量。 序列， 异mRNA的相对数量。内参是基因组中保守的 的相对数量 内参是基因组中保守的DNA序列，其 序列 表达恒定，因此在总 中所占的比例是大致恒定的。 表达恒定，因此在总RNA中所占的比例是大致恒定的。目标 中所占的比例是大致恒定的 基因在受到处理因素影响后，其表达量一般有所改变。 基因在受到处理因素影响后，其表达量一般有所改变。这样 扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化， 扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化，可以说明目 标基因的表达量的改变，做到半定量！内参一般选用如： 标基因的表达量的改变，做到半定量！内参一般选用如：βactin（β肌动蛋白）， （ 肌动蛋白），GAPDH（三磷酸甘油醛脱氢酶）等 肌动蛋白）， （三磷酸甘油醛脱氢酶）
常规PCR仪 仪 常规
实时定量PCR仪 仪 实时定量
TaqMan探针法 探针法
TaqMan探针法 探针法
TaqMan探针根据其 端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普 探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种： 探针根据其 端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种 通的TaqMan探针和 探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团 探针。 通的 探针和 探针 探针的淬灭基团 采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不 采用非荧光淬灭基团 ， 产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有 产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。 MGB (Minor Groove Binder)修饰基团（图5），可以将探针 修饰基团（ ），可以将探针 修饰基团 ）， 的Tm值提高 °C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针 值提高10° 左右。因此为了获得同样的 值 探针 值提高 左右 可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得 探针设计得更短，既降低了合成成本， 可以比普通 探针设计得更短 探针设计的成功率大为提高。因为在模板的 探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的 碱基组成不理想的 情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明， 情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB 探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 的模板可以区分得更为理想。 探针对于富含 的模板可以区分得更为理想
TaqMan探针法 探针法
TaqMan探针法是高度特异的定量 探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用 技术， 探针法是高度特异的定量 技术 其核心是利用Taq酶的 酶的 5′→3′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板 外切核酸酶活性， 外切核酸酶活性 切断探针，产生荧光信号。 是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 在TaqMan探针法的定量 探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条 反应体系中，包括一对 引物和一条 探针法的定量 反应体系中 探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。 探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探 针的5′端标记有报告基团 端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记 针的 端标记有报告基团 ， 、 等 端标记 有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候， 有荧光淬灭基团 ， 等 当探针完整的时候， 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随 着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 的进行， 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针， 的进行 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针 3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其 外切核酸酶活性就会将探针切断， 外切核酸酶活性就会将探针切断 报告基团远离淬灭基团， 能量不能被吸收，即产生荧光信号（ ）。所以 能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。所以，每经过一个 ）。所以，每经过一个PCR 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信 号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 的拷贝数。 号的强度就代表了模板 的拷贝数
SYBR Green I荧光染料技术 荧光染料技术
SYBR Green I荧光染料能 荧光染料能 与所有的DNA双链相结合， 双链相结合， 与所有的 双链相结合 模板没有选择性， 对DNA模板没有选择性，所 模板没有选择性 以特异性不如TaqMan探针。 以特异性不如TaqMan探针。 探针 要想用荧光染料法得到比较好 的定量结果， 的定量结果，对PCR引物设计 引物设计 的特异性和PCR反应的质量要 反应的质量要 的特异性和 求就比较高。在此前提下， 求就比较高。在此前提下，本 法是一种成本低廉的选择。 法是一种成本低廉的选择。
TaqMan探针法 探针法
SYBR Green I荧光染料技术 荧光染料技术
SYBR Green I荧光染料技术原理 荧光染料技术原理SYBR Green I是一 荧光染料技术原理 是一 种只与DNA双链结合的荧光染料（图6）。当它与 双链结合的荧光染料（ ）。当它与 种只与 双链结合的荧光染料 ）。当它与DNA 双链结合时，发出荧光； 双链上释放出来时， 双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧 双链上释放出来时 光信号急剧减弱。因此，在一个体系内， 光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表 了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量 了双链 分子的数量。 荧光染料法定量 分子的数量 PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染 的基本过程是： 、开始反应， 的基本过程是 染 料与DNA双链结合时发出荧光百度文库2、DNA变性时， 双链结合时发出荧光。 、 变性时， 料与 双链结合时发出荧光 变性时 SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚 染料释放出来， 染料释放出来 荧光急剧减少。 、 合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成 产物。 、 合延伸过程中，引物退火并形成 产物 染料与双链产物结合， 后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量 染料与双链产物结合 定量PCR系统 系统 检测到荧光的净增量加大。 检测到荧光的净增量加大。
半定量RT-PCR步骤 步骤 半定量
步骤： 抽提 抽提RNA，2.反转录获得 反转录获得cDNA，3.以cDNA 步骤： 1.抽提 ， 反转录获得 ， 以 为模板做PCR 为模板做 注意： 步骤 ，RNA抽提质量一定要好，注意污染。内 抽提质量一定要好， 注意： 步骤1， 抽提质量一定要好 注意污染。 参的选择，常用的有 两种。 参的选择，常用的有βactin和GAPDH两种。步骤 ，半 和 两种 步骤3， 定量RT-PCR应该在两管中进行，既内参和目的基因各一 定量 应该在两管中进行， 应该在两管中进行 管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！ 这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！ 指数期和平台期一定要摸清楚！ 指数期和平台期一定要摸清楚！
半定量RT-PCR是指通过总 是指通过总RNA逆转录为 逆转录为cDNA后，扩 半定量 是指通过总 逆转录为 后 增目标cDNA和内参 和内参cDNA，通过 增目标 和内参 ，通过PCR产物量推测样品中特 产物量推测样品中特 的相对数量。 序列， 异mRNA的相对数量。内参是基因组中保守的 的相对数量 内参是基因组中保守的DNA序列，其 序列 表达恒定，因此在总 中所占的比例是大致恒定的。 表达恒定，因此在总RNA中所占的比例是大致恒定的。目标 中所占的比例是大致恒定的 基因在受到处理因素影响后，其表达量一般有所改变。 基因在受到处理因素影响后，其表达量一般有所改变。这样 扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化， 扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化，可以说明目 标基因的表达量的改变，做到半定量！内参一般选用如： 标基因的表达量的改变，做到半定量！内参一般选用如：βactin（β肌动蛋白）， （ 肌动蛋白），GAPDH（三磷酸甘油醛脱氢酶）等 肌动蛋白）， （三磷酸甘油醛脱氢酶）
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TaqMan探针法 探针法
TaqMan探针法 探针法
TaqMan探针根据其 端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普 探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种： 探针根据其 端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种 通的TaqMan探针和 探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团 探针。 通的 探针和 探针 探针的淬灭基团 采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不 采用非荧光淬灭基团 ， 产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有 产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。 MGB (Minor Groove Binder)修饰基团（图5），可以将探针 修饰基团（ ），可以将探针 修饰基团 ）， 的Tm值提高 °C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针 值提高10° 左右。因此为了获得同样的 值 探针 值提高 左右 可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得 探针设计得更短，既降低了合成成本， 可以比普通 探针设计得更短 探针设计的成功率大为提高。因为在模板的 探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的 碱基组成不理想的 情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明， 情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB 探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 的模板可以区分得更为理想。 探针对于富含 的模板可以区分得更为理想
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TaqMan探针法是高度特异的定量 探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用 技术， 探针法是高度特异的定量 技术 其核心是利用Taq酶的 酶的 5′→3′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板 外切核酸酶活性， 外切核酸酶活性 切断探针，产生荧光信号。 是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 在TaqMan探针法的定量 探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条 反应体系中，包括一对 引物和一条 探针法的定量 反应体系中 探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。 探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探 针的5′端标记有报告基团 端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记 针的 端标记有报告基团 ， 、 等 端标记 有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候， 有荧光淬灭基团 ， 等 当探针完整的时候， 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随 着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 的进行， 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针， 的进行 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针 3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其 外切核酸酶活性就会将探针切断， 外切核酸酶活性就会将探针切断 报告基团远离淬灭基团， 能量不能被吸收，即产生荧光信号（ ）。所以 能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。所以，每经过一个 ）。所以，每经过一个PCR 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信 号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 的拷贝数。 号的强度就代表了模板 的拷贝数
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SYBR Green I荧光染料技术原理 荧光染料技术原理SYBR Green I是一 荧光染料技术原理 是一 种只与DNA双链结合的荧光染料（图6）。当它与 双链结合的荧光染料（ ）。当它与 种只与 双链结合的荧光染料 ）。当它与DNA 双链结合时，发出荧光； 双链上释放出来时， 双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧 双链上释放出来时 光信号急剧减弱。因此，在一个体系内， 光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表 了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量 了双链 分子的数量。 荧光染料法定量 分子的数量 PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染 的基本过程是： 、开始反应， 的基本过程是 染 料与DNA双链结合时发出荧光百度文库2、DNA变性时， 双链结合时发出荧光。 、 变性时， 料与 双链结合时发出荧光 变性时 SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚 染料释放出来， 染料释放出来 荧光急剧减少。 、 合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成 产物。 、 合延伸过程中，引物退火并形成 产物 染料与双链产物结合， 后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量 染料与双链产物结合 定量PCR系统 系统 检测到荧光的净增量加大。 检测到荧光的净增量加大。
半定量RT-PCR步骤 步骤 半定量
步骤： 抽提 抽提RNA，2.反转录获得 反转录获得cDNA，3.以cDNA 步骤： 1.抽提 ， 反转录获得 ， 以 为模板做PCR 为模板做 注意： 步骤 ，RNA抽提质量一定要好，注意污染。内 抽提质量一定要好， 注意： 步骤1， 抽提质量一定要好 注意污染。 参的选择，常用的有 两种。 参的选择，常用的有βactin和GAPDH两种。步骤 ，半 和 两种 步骤3， 定量RT-PCR应该在两管中进行，既内参和目的基因各一 定量 应该在两管中进行， 应该在两管中进行 管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！ 这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！ 指数期和平台期一定要摸清楚！ 指数期和平台期一定要摸清楚！