流式细胞术及其应用_百替生物

流式细胞术及其应用

作者：贾宇臣

第一部分流式细胞术的一般介绍

概念

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。

流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。

流式细胞仪特点

FACSCalibur

临床型（台式机）

特点：

光路调节系统固定

自动化程度高

操作简便

使用寿命长

配备1-2根激光

细胞分选速度慢，主要用于细胞分析

BD LSR

FACS Vantage DiVa

科研型（大型机）

特点：

多数字化

适用用各类细胞分选

4路分选

FACSAria

科研型

特点：

分辨率高

选配多种波长和类型激光器

可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析

流式细胞仪检测范围

临床研究

淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度

基础研究

淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究

流式细胞仪的工作原理

-光学系统

激光光源

光收集系统

-液流系统

流动室

液流驱动系统

-电子系统

光电转换

数据处理系统

-细胞分选系统

激光光源

单波长、高强度、高稳定性

多采用氩离子激光器或氦氖激光器

一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光最多检测13个荧光参数

光收集系统：滤光片

光收集系统：光电倍增管（PMT）

FACSCalibur 光路图

液流系统：流动室、液流驱动系统

液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱

细胞分选系统

Fluorescence Activated Cell Sorting

信号检测--散色光

它反应细胞FSC（小角散射)光它反应细胞的相对大小和截面积的大小SSC (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化

的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分信号检测--荧光信号

数据显示类型

X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系

Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率

便于数据统计

不同的细胞群可以用不同的颜色标记主要表达方式

光谱交叉

两色以上荧光分析存在光谱交叉

荧光补偿方法

所有补偿调为“0”

调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿

抗体使用原则

根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体

低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC

使用双标以上抗体必做荧光补偿

第二部分流式细胞术在不同领域的应用细胞周期分析

样品制备

建立获取模式，获取数据（PI单染分析细胞周期，同时看凋亡）

去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用

数据分析

细胞凋亡分析

Annexin V-PE/7-AAD双染色法

双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞

人外周血淋巴细胞亚群检测

T淋巴细胞检测

CD8+Ts淋巴细胞检测

B淋巴细胞检测

NK细胞检测

结束语

流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们的宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研等领域，报告最科学、最真实的客观数据，以服务于全社会。

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