SDS-PAGE-薄层扫描联用法测定三种不同来源的乳铁蛋白

SDS-PAGE-薄层扫描联用法测定
三种不同来源的乳铁蛋白
邢志恩，王军，戴蕴青，陈燕卉，陈敏*
（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）
摘要：目的：建立快速、简便测定鲜牛奶、转基因牛奶和人乳中乳铁蛋白的方法。

方法：在对样品脱脂和去除酪蛋白时，水洗乳脂、酪蛋白以提高乳铁蛋白的回收率。

通过SDS-PAGE电泳分离乳清蛋白，薄层扫描法定量。

对电泳和薄层扫描的条件进行了优化，电泳使用1.0mm×10齿的试样格，分离胶浓度12%，分离电压100V，上样量5µL，染色3h，脱色2h；薄层扫描采取锯齿、双波长、透射的扫描方式，Y步长和摆幅宽分别为0.1mm和8mm。

结果：可以分离不同来源乳中的乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。

乳铁蛋白加标回收率分别为104.53%、108.37%，重现性RSD为3.1003%和1.8151%，在100µg/mL~2000µg/mL 范围内呈线性关系，相关系数为0.9988和0.9990。

结论：此方法可以用于三种乳中乳铁蛋白的测定。

关键词：牛乳铁蛋白；重组人乳铁蛋白；人乳铁蛋白；SDS-PAGE；薄层扫描
收稿日期：
作者简介：邢志恩（1986-），男，在读硕士，从事乳中蛋白的研究。

Email：xingzhien0305@
*通讯作者：陈敏（1956-），女，教授，从事天然产物的研究。

Email：minch19@
Determination of three different sources of lactoferrin
by SDS-PAGE and thin layer chromatography scanning
Xing Zhi-en,Wang Jun，Dai Yun-qing,Chen Yan-hui,Chen Min*
（College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing100083,China）
Abstract:The aim of this study was the rapid and simple determination of lactoferrin from fresh bovine milk, transgenic bovine milk and human milk.After removing fat by centrifugation and precipitating caseins by adjusting pH,the lactoferrin contents were separated by SDS-PAGE(100V,12%gel,comb:1.0×10teeth,5µL injection,staining for3h and destaining for2h);and then the target fractions in the gel were examined by Thin Layer chromatography Scanning(transmission,zigzag scan,dual wave,swing width:8mm,delta Y:0.1mm).The results showed that it was available to separate3different sources of lactoferrin(LF),α-lactalbumin(α-La)and β-lactoglobulin(β-Lg).The linear range of determination was50µg/mL~2000µg/mL.The recovery by adding two kinds of lactoferrin standard samples was104.53%,108.37%.The precision of the method was excellent.
Key Words:bovine lactoferrin,recombinant human lactoferrin,human lactoferrin,SDS-PAGE,thin layer chromatography scanning
中图分类号：TS207.3文献标识码：A文章编号：
乳铁蛋白（lactoferrin,LF）是具有铁结合能力的糖蛋白，在哺乳动物的粘膜分泌物中被发现，其中初乳和常乳的含量最高[1]。

乳铁蛋白的分子量在80,000u左右，内含铁结合部位，铁含量越高，显现出的红色越深。

这种碱性蛋白的等电点为8.7[2]。

一个乳铁蛋白分子只有一条多肽链折叠形成[3]，含有大约690个氨基酸残基，现有研究证明人、牛、鼠、羊等动物体内的乳铁蛋白具有高度的同源性[4]。

人们已发现乳铁蛋白的多种生物活性，如广谱抗菌、抗病毒、抗癌、免疫调节[5]、抗氧化[6]等。

当今有厂家在乳制品中添加乳铁蛋白，制成功能食品，如婴儿配方奶粉、乳铁蛋白粉、牛初乳粉；也有研究将人乳铁蛋白的基因成功转入到牛体内，牛乳中含有的重组人乳铁蛋白含量可观[7]。

随着乳铁蛋白商业化的发展，建立一种快速、简便、精确、消耗少并可以广泛运用的检测方法，成为迫切解决的问
题。

SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是最常用的蛋白分离方法，乳铁蛋白只有一条肽链，在变性电泳上形成一个条带。

将电泳的条带进行薄层扫描（Thin Layer Chromatography Scanning,TLCS），扫描值与条带的光吸收值，即蛋白浓度，成线性相关。

本实验旨在建立一种快速、简便的乳制品前处理过程、并运用SDS-PAGE-薄层扫描联用的方法定量检测乳制品中牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin,bLF)、人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)和重组人乳铁蛋白的含量(recombinant human lactoferrin,rhLF)。

1材料与方法
1.1材料、试剂和仪器
乳铁蛋白Ⅰ（即牛乳铁蛋白，纯度95%，产地日本，上海贝基生物科技有限公司）、乳铁蛋白Ⅱ（从转基因牛奶中提取，中国农业大学农业生物技术国家重点实验室提供）、牛α-乳白蛋白（纯度85%，Sigma）、牛β-乳球蛋白（纯度90%，Sigma）。

鲜牛奶（购于农大家属区，取奶后未经处理）、人乳（北京西苑医院提供，满月第八天）、转基因牛奶（转人乳铁蛋白基因，中国农业大学农业生物技术国家重点实验室提供）。

分析纯：盐酸、甲醇、醋酸；电泳级：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、过硫酸铵（AP）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）、巯基乙醇、甘油、考马斯亮蓝G-250、溴酚蓝。

高速冷冻离心机（GL-20B，上海安亭科学仪器厂）、pH计（PP-15，德国赛多利斯公司）、电泳槽（DYCZ-24，北京六一仪器厂）、电泳仪（DYY-10C，北京六一仪器厂）、摇床（SHZ-88，太仓实验设备厂）、双波长飞点薄层扫描仪（CS-9301，日本岛津公司）、微型旋蜗混合仪（WH-2，上海沪西分析仪器厂）、微量进样器（10μL，上海高鸽工贸有限公司）。

1.2样品的预处理
1.2.1转基因牛奶和人乳的预处理
量取样品奶液10mL，离心脱脂，取水层；将3mL去离子水加入脂肪层，涡旋3min洗涤其中残留的乳铁蛋白，离心，共清洗2次，合并水相。

用2mol/mL盐酸将水相调节至pH4.6。

室温静置40min 待酪蛋白沉淀，离心，收集上清液；再用3mL去离子水加入酪蛋白层涡旋3min，离心，收集上清液，共清洗2次，合并水相，定容至25mL，4℃保存备用。

上述离心操作均在4℃条件下以3,000r/min进行15min。

1.2.2鲜牛奶的预处理
量取样品奶液15mL，清洗脂肪层1次，酪蛋白层2次。

其余步骤与1.2.1相同。

1.3标准溶液的配制
准确称取20.00mg的乳铁蛋白Ⅱ（LFⅡ）标准品，用去离子水溶解，定容到10mL（2000μg/mL），并依次稀释为1500µg/mL、1000µg/mL、500µg/mL、100µg/mL、50µg/mL。

用于测定。

牛乳铁蛋白（bLF）标液的配制同LFⅡ。

1.4SDS-PAGE条件
电泳之前，取100µL样品液，加入等体积的样品缓冲液（2×），沸水加热5min，冷却备用或-20℃贮存。

分离胶浓度12%，浓缩胶浓度4.5%；恒压电泳，分离电压100V，浓缩电压60V；试样格1.0mm×10齿；上样量5µL。

染色液：0.1g/mL考马斯亮蓝G-250、45%甲醇、10%醋酸的水溶液；脱色液：25%甲醇、10%醋酸的水溶液。

电泳结束后，在半径为6cm的培养皿里，加入100mL去离子水浸泡10min，浸出SDS；加入染
色液25mL，摇床80n/min，染色3h；0h、1h和1.5h时，各加入脱色液50mL，共脱色2h。

1.5薄层扫描条件
扫描方式：锯齿，双波长，透射；Y步长0.1mm；摆幅宽8mm。

双波长的确立：将光束的斑点移到电泳凝胶的条带上，进行全波长扫描，得到的最大吸收波长，即为样品波长；同样，凝胶空白处的最大吸收波长，即参比波长。

2结果与分析
2.1样品前处理条件的选择
虽然SDS-PAGE对奶液可以直接进行蛋白分离，但由于牛奶中高含量的乳脂（3.8%）和酪蛋白（占蛋白总含量的80%）会严重干扰目标蛋白的分离效果。

被测目标乳铁蛋白是乳清蛋白的成分之一，去除乳脂和酪蛋白后得到乳清，则去掉了电泳分离、薄层扫描检测中的两个最大干扰，并省略其他提纯乳铁蛋白的繁琐步骤，如硫酸铵沉淀[8]、各种层析[9]、超滤[10]等。

同时为减小乳脂和酪蛋白分离时目标蛋白的损失，水洗脂肪层和酪蛋白层，收集残留在其中的乳铁蛋白。

取转基因牛奶10mL作为样品，对脱脂后的脂肪层和酸法沉淀后的酪蛋白层分别水洗4次，收集每次的水洗液用SDS-PAGE电泳监测乳铁蛋白条带浓度的变化，所得的电泳结果如图1所示。

图1转基因牛奶乳脂、酪蛋白水洗液的电泳图
Figure1SDS-PAGE of solution of fat and casein form transgenic milk
由图1可见，水洗次数愈多，目标蛋白在水相的含量愈少，因此保证一定的水洗次数可提高回收率；但水洗次数增多，合并洗出液后会降低待测样品液中的蛋白浓度，所以需要有足够的样品量，否则需对样品液进行浓缩。

综合考虑上述两个方面，确定对乳铁蛋白含量较高的转基因牛奶和人乳每次取样10mL，乳脂和酪蛋白各水洗2次。

鲜牛奶中乳铁蛋白含量相对较少，确定每次取15mL鲜牛奶，对其乳脂水洗1次、酪蛋白水洗2次。

乳清定容到25mL待测。

2.2SDS-PAGE条件的选择
2.2.1试样格以及凝胶厚度的选择
试样格齿的大小会改变电泳条带的形状，其厚度与凝胶的厚度对应，这些会对蛋白条带的薄层扫描结果产生影响。

选用同一种处理过的奶液，分别使用1.0mm×10齿、1.0mm×15齿、1.5mm×10齿的试样格，薄层扫描三种不同的凝胶条带，所得结果如图2。

图2不同梳子对薄层扫描图的影响
Figure2Impact of different combs on TLCS
1.0mm××15齿、
1.0mm××10齿、Ch2：1.5mm
1.5mm××10齿、Ch3：1.0mm
Ch1：1.0mm
1.0mm××15teeth
1.5mm××10teeth,Ch3:1.0mm
Ch1:1.0mm
1.0mm××10teeth,Ch2:1.5mm
根据图2，从薄层扫描目标峰的形状和分离程度分析，使用1.0mm×10齿（Ch1）的试样格，目标蛋白实现了基线分离，有利于定量扫描；且1.5mm厚的梳子（Ch3）凝胶脱色时间比1.0mm（Ch1）多出一倍。

因此选用1.0mm×10齿的试样格。

2.2.2进样量
配置2000µg/mL、100µg/mL的牛乳铁蛋白标准溶液，分别上样10.0µL、8.0µL、5.0µL、3.0µL
电泳。

所得凝胶条带如图3。

图3不同浓度、不同进样量的电泳图
Figure3SDS-PAGE of different concentration and injection volumn
由图3可见，进样量越多，会对蛋白条带分离产生的影响越大。

2000µg/ml的标液进样8µL、10µL
时得到的条带与相邻的条带距离相近，影响扫描；而100µg/mL标液进样5µL的电泳条带仍较清晰，
因此，确定进样量为5µL。

2.2.3分离胶和分离电压的选择
由于定量的要求，采取分辨率高的不连续电泳，分离胶浓度参考李珊珊[11]的电泳条件，确定12%
最为合适。

考虑到电泳过程中，产热对条带的非预期影响，电泳的电压设定为恒定[12]。

电压过大，产
热加强；过小，时间延长，条带扩散明显，结合电泳槽和电泳仪的要求，确定分离电压为100V。

2.2.4染色脱色时间
考虑经济、简便的目的，采用传统的考马斯亮蓝G-250染色方法。

染色时间保持在3h，会比较
充分；虽然有通过加热的快速染色方法[13]，但加热对凝胶及条带有不可把握的影响，故采取常温摇床
染色的方式。

为减少脱色时间，实现条带有效分离，并使凝胶的背景干扰少，实验对染色3h的凝胶，
分别脱色2h、2.5h、3.0h和12h（0h、1h、1.5h时各换一次脱色液）。

所得条带的薄层扫描结果显示，
四种脱色条件下，蛋白条带都较清晰，样品分离较好。

但增加脱色时间，效果不明显。

因此确定脱色
为2h。

2.3标品和样品的SDS-PAGE电泳分离结果
牛乳铁蛋白（bLF）、乳铁蛋白Ⅱ（LFⅡ）、α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）的标样，鲜牛奶（加标）、转基因牛奶和人乳处理后乳清的SDS-PAGE电泳结果如图4所示。

图4标品和样品的SDS-PAGE凝胶图
Figure4SDS-PAGE of standards and samples
Ch1：β-乳球蛋白（β-Lg），Ch2：人乳，Ch3：转基因牛奶，Ch4：乳铁蛋白Ⅱ（LFⅡ），
Ch5：牛乳铁蛋白（bLF），Ch6：加标鲜牛奶，Ch7：α-乳白蛋白（α-La）
Ch1:β-lactoglobulin,Ch2:Human milk,Ch3:Transgenic bovine milk,Ch4:LactoferrinⅡ,
Ch5:Bovine lactoferrin,Ch6:Fresh bovive milk(adding bLF),Ch7:α-lactobumin Ch1、Ch4、Ch5和Ch7分别是β-Lg、LFⅡ、α-La、bLF的标样，由图可见，四种蛋白的电泳条带清晰，与报道中的分子量相符。

Ch2、Ch3、Ch6分别是人乳、转基因牛奶和鲜牛奶（加标）乳清的电泳分离图。

根据标准品的迁移率，三种奶液通过本电泳条件都能有效分离LF、α-La、β-Lg三种主要成分。

人乳中不含β-Lg[14]，这也从Ch3的结果得到证实。

转基因牛成功分泌了重组人乳铁蛋白；而普通牛常乳中，只含有微量的LF，图中Ch6为加标鲜牛奶（加标量为0.1850mg/mL）。

由于人乳、牛奶和转基因牛奶中乳铁蛋白的同源性，三种蛋白虽然在分子结构上有区别[15]，但分子量上差异不大。

2.4薄层扫描条件的优化
凝胶本身对光有吸收，故采用双波长的扫描方式以降低凝胶的干扰。

薄层扫描有线性和锯齿两种扫描方式。

线性扫描是尺寸大于通道的光斑，沿着直线扫描样品条带；锯齿扫描，尺寸小于条带宽度的光斑，逐点沿条带方向扫描，形成锯齿形扫描，每个条带的数据都是多个点扫描结果的累加值。

实验所得，锯齿、线性扫描对相邻两峰的分离效果相似。

实验选择灵敏度高的锯齿扫描方式。

薄层锯齿扫描的光束斑点扫描精密情况，为Y步长，共有0.2mm，0.1mm、0.04mm、0.02mm、0.01mm 5种。

Y步长越小，扫描越精密，但时间越长；Y步长越大，扫描越粗糙，但时间越短。

5种方式对本实验样品分离效果相似，兼顾缩短扫描时间和降低基线噪音，确定使用0.1mm的Y步长进行扫描。

摆幅宽是光束扫描条带的半径，摆幅宽≥电泳条带的长度。

根据所选1.0mm×10齿的梳子所得的条带，选用摆幅宽为8mm的扫描方式。

2.5方法学考察
2.5.1乳铁蛋白线性关系考察
LFⅠ（bLF）和LFⅡ标准品以50µg/mL至2000µg/mL浓度梯度按照上述方法进行电泳展开
和薄层扫描。

以质量浓度对应电泳条带的薄层扫描峰面积进行线性相关，得出结果如表1。

表1两种蛋白标液的线性关系实验结果
Table1Data of calibration curves of two standard solutions
标准样品浓度范围（µg/mL）回归方程相关系数
牛乳铁蛋白100~2000Y=2.9211X-5.93550.9988
乳铁蛋白Ⅱ100~2000Y=2.7770X-135.360.9990
2.5.2精密度考察
2.5.2.1同板精密度试验
精密量取bLF标准准样品5份，经过电泳并薄层扫描，记录扫描峰面积，求出RSD值。

bLF标品精密度实验结果如下：4222.471、4091.152、4128.691、3882.664、4031.242，RSD值为3.1003%；同bLF，LFⅡ标品精密度实验结果如下：3675.506、3601.87、3606.01、3600.647、3751.162，RSD 值为1.8151%。

由上得出，同板展开时本方法精密度良好。

2.5.2.2校正系数的引入
SDS-PAGE电泳选用10齿的试样格，即每块凝胶只能测得10个样品。

实验证明，同一样品在不同凝胶板之间上的扫描结果存在微小差异。

为纠正不同凝胶板之间的偏差，引入校正系数（λ）。

选择一个接近样品浓度的标准品，作为随行标样，在凝胶上同时进行电泳。

所得条带的扫描值（S）与标准曲线相同浓度的扫描值（S0）进行比较，得出λ=S0/S，作为此块凝胶上样品的校正系数。

通过A=λAo （Ao，样品条带的扫描值）公式，把A带入标准曲线方程中，求出对应的样品浓度。

2.5.3重现性考察
按照1.2.1和1.2.2对三种乳进行处理，1.4、1.5方法检测3种样品中乳铁蛋白含量，不同时间重复5次，所得重现性结果如表2。

鲜牛奶中乳铁蛋白使用bLF作为标准样品，人乳和转基因牛奶使用LFⅡ作为标准样品。

表2重现性实验结果
Table2Repeatability
样品校正系数λ
校正后LF
平均峰面积LF平均质量
浓度(mg/mL)
RSD值
鲜牛奶 1.0573769.27860.4423 1.7732%转基因牛奶 1.07782472.0634 2.347 1.5181%人乳 1.27431879.0294 1.813 3.6898%由表2可见，本方法重现性良好。

2.5.4方法回收率
分别在鲜牛奶和转基因牛奶中添加不同质量的bLF和LFⅡ，检测出回收率结果如表3所示。

表3bLF和LFⅡ回收率实验结果
Table3The recovery of bLF and LFⅡ
鲜牛奶转基因牛奶
序号
加标量
(mg/mL)
样品本底值
(mg/mL)
实际测定
值(mg/mL)
回收率
加标量
(mg/mL)
样品本底值
(mg/mL)
实际测定
值(mg/mL)
回收率
10.18500.44230.6384106.00% 1.128 2.347 3.630113.74% 20.29750.44230.7521104.13% 2.204 2.347 4.743108.71% 30.65000.4423 1.1147103.45% 4.536 2.3477.004102.67%由表3所示，bLF的平均加标回收率为104.53%；LFⅡ的平均加标回收率为108.37%。

3结论
本文构建的SDS-PAGE分离、薄层扫描检测的方法，可以用来定量测定三种不同来源乳铁蛋白的含量。

样品前处理条件的优化保证了回收率，SDS-PAGE可以有效分离乳清中的乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。

此检测方法相对简单，灵敏度高，准确度、重复性较好，并且克服了溶剂的大量损耗，便于使用。

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