AFLP标记技术及其在猪遗传育种中的应用

畜牧兽医科技信息２００７．０７
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作者简介：任斌（１９８１～），男，硕士研究生，研究方向：动物分子数量遗传育种。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｅｎｂｉｎ２０５０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ%通讯作者：黄生强（１９６８～），男，副教授，硕士生导师．研究方向：分子遗传与动物育种。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｓｑ３２１＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
前言
扩增片段长度多态性（ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙ－
ｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）技术是由Ｚａｂｅａｕ等１９９２年发明的，并于１９９３年获得欧洲专利局专利。

它是在ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ结合的基础上发展起来的，克服了两者各自的缺点，而集中了二者的优点，它既有ＲＦＬＰ的可靠性，又有ＲＡＰＤ的方便性。

ＡＦＬＰ被认为是迄今为止最为有效的分子标记，不管基因组ＤＮＡ有多么复杂，理论上讲，用ＡＦＬＰ方法都可以检测出它们的多态性。

它不仅具备了多态性丰富、共显性表达、不受环境影响、无复等位效应的特点，而且还具带纹丰富、用样量少、灵敏度高、快速高效的特殊优点。

一个０．５ｍｇＤＮＡ样品，可做４０００个反应，获得８万个标记，６５０万条带纹。

通过实验验证，ＡＦＬＰ被认为是一种理想的有效的分子标记，已用于基因鉴定!基因作图!基因表达等方面。

目前，不仅在水稻、小麦和棉花等主要农作物上得以应用，还在羊、猪和狗等动物遗传育种中得到广泛应用。

本文将主要对ＡＦＬＰ标记技术在猪遗传育种中的应用加以综述。

１ＡＦＬＰ的发生发展!基本原理及其技术流程
１．１ＡＦＬＰ的发生发展ＡＦＬＰ（ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）是１９９２年由荷兰科学家Ｚａｂｅａｕ和Ｖｏｓ发展起来的一种检测ＤＮＡ多态性的新方法。

至今正式发表的关于ＡＦＬＰ的论文还不多，可实际上做这方面研究的人已很多。

首先在棉花，水稻等农作物的遗传育种等方面得以快速应用，粟米群等［６］应用ＡＦＬＰ标记鉴定小豆栽培型种质遗传多样性认为ＡＦＬＰ是一种可靠又理想的遗传标记方法。

后来有研究者将其技术应用到动物遗传育种中，也取得了不错的成绩。

Ｍ．Ｏｓｔｅｎ等人利用ＡＦＬＰ技术鉴定２７个小鼠近交系，结果只用了两个酶引物组就得到了所有供试品系的特异谱带W 万春玲等将ＡＦＬＰ用于家蚕的遗传多态性研究，结果发现在家蚕中同样具有丰富的ＡＦＬＰ标记的多态性。

１．２
ＡＦＬＰ的基本原理
ＡＦＬＰ是通过限制性内切酶片段的
不同长度检测ＤＮＡ多态性的一种ＤＮＡ分子标记技术。

它首先通过ＰＣＲ反应把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的分析胶上进行电泳检测。

实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后ＰＣＲ反应的引物结合位点。

实验中，根据需要通过选择在末端上分别添加了１～３个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。

１．３ＡＦＬＰ的技术流程ＡＦＬＰ技术流程主要包括三个步骤：①经限制性内切酶酶解后的ＤＮＡ限制性片段，与双链多聚核昔酸接头（ａｄａｐｔｅｒ）连接W ②利用ＰＣＲ方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的限制性片段，经过多次循环，可使目的序列扩增到０．５－ｌｕｇW ③用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测扩增的ＤＮＡ片段。

２
ＡＦＬＰ的技术特点
因ＡＦＬＰ具有ＲＦＬＰ技术的可靠性，ＲＡＰＤ技术的多态性和ＰＣＲ技术的高效性，可在一个反应内检测大量限制性片段，典型的ＡＦＬＰ分析每次反应的产物经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测到的谱带数在５０－１００条之间，多态性好的酶切引物组合，一次可检测到２０个以上的多态性，所以是多态性检测的一个非常有用的技术，非常适合于遗传多样性研究、品种指纹图谱的绘制、连锁遗传图的构建以及基因定位等领域。

ＡＦＬＰ的另一个重要特点是：在反应过程中标记的引物全部耗尽后，扩增带型将不受循环数的影响，由于ＡＦＬＰ对模块浓度不敏感，即使模板浓度存在一些差异，利用过剩的循环也会得到浓度一致的谱带，因此ＡＦＬＰ技术能够检测谱带强度多态性。

ＡＦＬＰ标记技术的主要不足是：要使用同位素或非同位素标记引物，费时耗财W 同时实验的步骤多，流程长，优化每一步的条件十分重要，操作较为繁琐。

３
ＡＦＬＰ在猪遗传育种中的应用
由于ＡＦＬＰ结合了ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ各自的优点，方便快速，只需极少量ＤＮＡ材料，不需Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，不需预先知道ＤＮＡ的顺序信息，实验结果又稳定可靠，可快速获得大量的信息。

ＡＦＬＰ产物呈典型的孟德尔方式遗传，因此ＡＦＬＰ被称为最有力的分子标记。

它可以应用于一般分子标记的所有应用范围，如猪品种／系的鉴定、遗传多样性分析、基因定位、连锁图的构建、猪的抗病育种和标记辅助选择育种等等。

３．１
猪品种、品系的鉴定
ＡＦＬＰ的最适应用范围，是鉴定品
种指纹、检测品种的质量和纯度、辨别真伪，十分灵敏。

因ＡＦＬＰ技术可在较短的时间内检测出大量多态性标记，与ＲＡＰＤ、ＲＦＬＰ等标记一样，是基于对种质基因组ＤＮＡ水平的差异进行检测，不受组织和器官种类!发育阶段!环境条件
ＡＦＬＰ标记技术及其在猪遗传育种中的应用
任
斌，黄生强Z
（湖南农业大学动物科技学院，长沙４１０１２８）
摘
要：ＡＦＬＰ标记是近年来发展最为有效的一种检测ＤＮＡ多态性的分子标记技术。

本文系统论述了ＡＦＬＰ技术的发生发展、基本原理、特点及近年来国内外的研究概况，并集中探讨了这一分子遗传标记在猪遗传育种中的应用及其发展前景。

关键词：ＡＦＬＰ；猪；遗传育种专论与综述
等诸多因素的影响，非常适合鉴定种系的ＤＮＡ指纹。

ＣａｍｅｒｏｎＮＤ等利用ＡＦＬＰ分子标记技术对９个品系的２７０头试验猪进行辨别鉴定，得到了２３９个多态性ＡＦＬＰ标记，分析结果表明：应用ＡＦＬＰ标记技术可鉴定辨别来自于同一个基础群的不同猪品系7同时也说明该标记可用于区分遗传背景或外观形态极其相似的猪品系，为猪的遗传质量分析和品系鉴定提供参考资料。

３．２遗传多样性分析ＡＦＬＰ标记可以通过选用少量效率高的引物组合，获得覆盖全基因组的ＡＦＬＰ标记，用于种质资源的遗传多样性分析。

任军、黄路生等利用１２对ＡＦＬＰ引物组合检测了１９个中国地方猪种、１个培育猪种和４个欧美引进猪种混合基因组ＤＮＡ的遗传变异。

根据结果计算了２４个猪种之间的遗传相似系数，构建ＵＰＧＭＡ聚类关系图，结果表明：ＡＦＬＰ标记有着很高的多态检测效率，非常适合于猪种（群）遗传多样性分析和品种鉴定。

结果也进一步表明中国地方猪种与国外猪种间的亲缘关系较远，这与育成历史、地理分布和ＲＡＰＤ分析结果相一致。

ＫｉｍＫｓ等利用３对ＡＦＬＰ引物对韩国六个猪种（包括一个本地品种）进行遗传变异和遗传关系的研究，结果表明：韩国地方猪种遗传变异不大，与引进猪种的亲缘关系较远，这与以前应用微卫星分析所得结果相一致。

ＳａｎＣｒｉｔｏｂａｌＭ等利用１４８个ＡＦＬＰ标记引物对５８个欧洲猪种和１个中国猪种进行了基因型分析，并与以前用５０对微卫星标记同样品所得结果进行了比较分析，两者结果差异不大，数据间还可以相互补充。

结果也表明：ＡＦＬＰ标记可结合微卫星对猪的遗传多样性进行评估分析。

３．３基因定位基因定位克隆技术是分离未知产物基因的一种重要技术，其基本前提就是先基因定位，然后以紧密连锁的分子标记作为起点，通过染色体步行，最终实现基因克隆过程。

江昱曾在文中提到说，１９９８年，Ｇ．Ｓ．ＰＬａｓｔｕｗ等人报道了通过４２０对ＡＦＬＰ引物检测了１３个可能与猪毛色基因相关的标记。

其中ＣＯＬＩ标记与毛色基因Ｉ呈显著的连锁不平衡。

３．４连锁图谱的构建连锁图谱的构建是对基因组进行系统性研究的基础，也是对动植物遗传育种和人类遗传病诊断的依据，将使标记辅助选择技术的应用成为现实，从而可能从根本上改变传统的育种方法。

实践证明在ＡＦＬＰ多态性产物中可以定位于基因的部分所占的比例相当多，因而ＡＦＬＰ可以构建高密度的遗传图，使基因组能完全被分子标记覆盖，而没有很大的标记空隙，可以检测数量性状基因（ＱＴＬ）。

吴丰春等报道了ＡＦＬＰ标记在研究贵州小型香猪遗传遗传多样性方面的应用和该品系猪个体基因组ＤＮＡ的ＡＦＬＰ的扩增结果，并分析了贵州小型香猪的群体遗传结构。

３．５用于猪的抗病育种猪的抗病育种主要围绕与猪主要生产性能和抗病性、致病性间的关系而展开。

ＡＦＬＰ分子标记技术的目的就是寻求与主要生产性状和抗病、致病基因相连锁的ＤＮＡ片段，然后探讨将其用于早期选择，甚至出生前选择的可能性。

ＢａｕｍｓＣＧ等利用ＡＦＬＰ技术对引起人畜共患髓膜炎的猪链球菌进行基因型分析，得到四种基因型，对所得数据作了相关性分析，为猪和人的猪链球菌病的预防、诊断和控制提供了参考依据。

ＮｅｊｓｕｍＰ等利用ＡＦＬＰ标记分析了丹麦本国猪种体内蛔虫的群体结构，并进一步研究了蛔虫分布的地区差异及传染传播的可能途径，为蛔虫病的预防诊治提出了可行的办法。

ＭｏｒｅｎｏＡＭ等选择９７个取自患有肺炎、萎缩性鼻炎和败血症猪体的不同来源的猪多杀性巴斯德杆菌亚种，利用单酶－ＡＦＬＰ标记（ＳＥ－ＡＦＬＰ）技术进行相关分析，获得了Ａ、Ｄ、Ｆ三种基因型，且把这９７个不同的菌株系统的分为了１８个不同的类群，研究结果显示：不同类群间的差异指数达到了０．８７。

３．６标记辅助选择育种标记辅助选择就是对特定主基因座位或数量性状基因座位在遗传标记辅助下区分其基因型，并在此基础上应用于畜禽的育种实践。

ＷｉｍｍｅｒｓＫ等选择杜洛克和柏林猪Ｆ２代杂种猪作为实验材料，利用４８对ＡＦＬＰ组合引物研究并找寻影响眼肌面积、胴体长等的基因座。

结果证实，在４号染色体，在ＳＴＳ（ＳＴＳ－Ｂｏ１和ＳＴＳ－Ｂｏ３）标记处存在着影响眼肌面积、胴体长和背膘厚的重要的ＱＴＬ（ｐ＜０．０１）。

研究结果进一步表明，ＡＦＬＰ标记分析结合基因型的选择可以作为一种检测家畜中包含有ＱＴＬ的染色体组区域的方法，为标记辅助选择育种提供了有力的参考。

４前景与展望
由于对基因微小差异的高度敏感性，以ＰＣＲ技术为基础的ＡＦＬＰ分子标记，将成为近段时期内最为主要的分子遗传标记工具。

ＡＦＬＰ具有的高度可靠性将可以代替ＲＡＰＤ分子标记，而ＡＦＬＰ的绝对方便性也会使其他具有高分辨率的ＲＦＬＰ和微卫星标记技术失色。

但是，任何现在广泛应用的分子标记都有其优缺点，ＡＦＬＰ也存在着对模板反应表现迟钝、谱带也可能发生错配与缺失、成本相对比较高、对技术要求也比较苛刻等缺点，但随着分子生物技术的飞速发展，ＡＦＬＰ操作步骤的简单化、规范化和其自动化，ＡＦＬＰ标记的效率会有进一步的提高，应用范围会不断扩大，ＡＦＬＰ技术必将日益成为遗传学家和分子生物学家手中强有力的研究工具。

它在目前作为一种高效的指纹技术，在猪遗传育种研究中发挥着它独特的优势，必将会加快猪遗传育种的步伐，也必将促进国内猪产业的飞速发展，带来巨大的经济利益和研究价值。

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专论与综述
畜牧兽医科技信息２００７．０７１５
畜牧兽医科技信息２００７．０７
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粘蛋白（ｍｕｃｉｎｓ简称ＭＵＣ）是广泛分布于机体正常各粘膜表面的为分子量４０万以上的高分子量的糖蛋白，迄今已发现有１３种（ＭＵＣ１－ＭＵＣ１３）。

粘蛋白在正常人体内主要存在胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道、及乳腺等多种上皮组织顶端，对正常的上皮起润滑和保护作用，同时还在肿瘤、癌的发生与转移等方面都起到重要作用。

１
ＭＵＣ１的生化结构和功能
ＭＵＣ１基因是通过筛选从乳腺癌、胰腺癌等细胞系构建的ｃＤＮＡ表达文库克隆而得到的。

人的ＭＵＣ１基因定位于染色体１ｑ２１，Ｃｄｎａ长１８２１ｂｐ，含有７个外显子，其中第２个外显子含有串联重复序列（ｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｓ，ＶＮＴＲｓ）。

每个ＶＮＴＲｓ含有６０个碱基，富含ＧＣ。

不同人的ＶＮＴＲｓ数量从２０（１２５不等，其表达产物由２０个氨基酸组成，它们是ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ。

ＭＵＣ１基因的编码产物ＭＵＣ１粘蛋白是一种具有跨膜序列的附膜糖蛋白，其分子由核心蛋白和糖链组成。

其中糖链约占其重量的５０％～９０％，糖链多以Ｏ－型糖苷键与核心蛋白的苏氨酸、丝氨酸残基连接。

核心蛋白富含苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基。

核心蛋白总称为ＭＵＣ，按发现的顺序进行标号，其中ＭＵＣ１、３、４、１２是膜结合型粘蛋白，而ＭＵＣ２、５ＡＣ、５Ｂ、６、７是分泌型粘蛋白。

核心蛋白由跨膜区、胞内区和胞外区三部分组成。

跨膜区（３１个氨基酸残基）和短的、不被糖基化的胞质区（５６个氨基酸残基）在不同种间结构是高度保守的，可能与其组织表达的特异性有关；胞质区可以被磷酸化，并且似乎与细胞骨架有关。

ＭＵＣ１在粗面内质网合成，
穿过滑面内质网和高尔基复合体并在其中被糖基化，然后被转运到细胞表面；胞外区决定着ＭＵＣ１粘蛋白特异性的空间结构和免疫原性。

ＭＵＣ１含有一个大的细胞外区，外周Ｏ－糖链含有１～２０个单糖，由核心区、骨架区和外周区组成，这些区域决定了ＭＵＣ１生化特性和免疫功能。

大量的脯氨酸残基和广泛Ｏ－糖基化的丝氨酸、苏氨酸残基形成了一个具有高度延展性的刚性结构，突出细胞周围２００～５００ｎｍ。

ＭＵＣ１的功能早期认为主要局限于其保护细胞免受细胞外物质的侵害、黏性维持、细胞识别和起润滑剂的作用。

现在研究认为它不仅有助于上皮更新与分化、维持上皮完整性，而且在肿瘤、癌的发生与转移等方面都起到重要作用。

在肿瘤发生过程中，黏蛋白可影响肿瘤细胞的黏附力、免疫识别、转移和预后。

大量研究表明黏蛋白基因的表达具有组织和细胞特异性，其蛋白表达的改变在肿瘤发生和细胞分化中起着重要作用，同时上皮细胞的恶变也与其质与量的改变相关。

近年由于ＭＵＣ１基因成功地被克隆，并随着对ＭＵＣ１研究的逐渐深入，发现ＭＵＣ１是一种具有多种功能的大分子量糖蛋白，在不同情况下有时甚至表现出截然相反的功能，如同时具有粘附和抗粘附作用，免疫活化和免疫抑制作用等。

基于ＭＵＣ１的抗黏附特性，他可以使内膜保持在非容受性状态，因此母体内膜细胞表面表达的这种糖蛋白是胚胎植入的屏障。

ＭＵＣ１的表达可以通过ＤＮＡ、ｍＲＮＡ和蛋白水平进行检测。

２
ＭＵＣ１的表达
ＭＵＣ１在内膜的表达随月经周期而变化，物种间亦有不同。

在所有被检测的物种当中，
ＭＵＣ１在内膜上皮细胞内ＭＵＣ１粘蛋白的生物学功能与乳ＭＵＣ１多态性研究进展
韩瑞华１，何晓刚２Q
（１．西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌７１２１００；２．铜川市畜牧兽医中心站，陕西铜川７２７０００）
作者简介：韩瑞华（１９８１～），女，陕西扶风人，硕士，研究方向为动物遗传育种与繁殖。

)通讯作者：何晓刚，陕西省铜川市畜牧兽医中心站
专论与综述
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