第二章 菌种选育

第二章菌种选育带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置一、菌种的来源•根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；•从大自然中分离筛选新的微生物菌种。

1、分离思路•新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。

•实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。

•有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。

2、新种分离与筛选的步骤3、具体方法•1）采样•2）样品的预处理•3）纯种分离•4）生产性能的测定1）采样（1）采样对象以采集土壤为主。

一般田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。

采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。

从自然界筛选•（2）采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。

•（3）采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。

为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。

2）样品的预处理•在分离之前，含微生物材料的标本首先进行预处理，可大大提高菌种分离的效率。

3）纯种分离•在自然界获得的标本，是很多种类微生物的混杂物，一般采用平板划线或平板稀释法进行纯种分离。

•由于土壤或其它样品中所含的各种微生物数量有很大差别，若估计到要分离的菌种的数量不多时，就得设法增加分离的机率，可通过富集培养增加该菌种的数量。

•利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的，这种方法又被称为施加选择性压力分离法。

平板划线分离稀释分离分离的培养条件--控制营养成分•各种微生物对营养物质的要求是有差异的。

控制分离培养基的营养成分对提高分离效果是有好处的。

•用淀粉作为唯一碳源，则具有淀粉酶类的微生物就能很好生长。

在一般情况下，也可以按照各大类微生物常用的培养基进行分离，例如分离细菌常用蛋白胨牛肉膏琼脂培养基，分离放线菌常用淀粉琼脂培养基，分离酵母、霉菌常用麦芽汁或米曲汁培养基等。

分离的培养条件--培养基酸碱度•微生物生长繁殖的适宜酸碱度是不同的。

细菌和放线菌一般要求中性或偏碱性的培养基（pH7.0或稍高），酵母和霉菌一般要求偏酸性（pH4.0~6.0）。

所以，结合一定的营养，将培养基调至一定的pH值，更有利于排除不需要的微生物类型。

•筛选一些产有机酸类型的菌种，采用控制pH值的方法更为见效。

例如，用酸性滤纸法筛选柠檬酸产生菌，就是利用含30%甘薯粉醪和10%的柠檬酸的培养基，使pH值在2.0~2.5。

将这种培养基和土壤稀释液相混合，用无菌毛细管吸取少量，点布在铺于培养皿中的灭菌滤纸上（2~3层），在30℃培养，这样得到的菌种几乎全部是产柠檬酸的黑曲霉。

若要分离其它霉菌，在分离培养基中滴加几滴乳酸就可抑制细菌生长。

热处理•每一种微生物都有它的最高生长温度，超过最高生长温度就不能生长和繁殖，甚至死亡。

•热处理就是根据芽孢对热的耐性而淘汰不产芽孢的细菌和其他微生物。

一般不产芽孢的细菌和其他微生物的营养型细胞，在60-70℃温度下10分钟被杀死，而芽孢则能抵抗100℃或更高的温度。

•要筛选芽孢杆菌，可将样品稀释液经过80℃，10分钟的水浴处理，将不产芽孢的营养细胞杀死，然后再进行分离，这样的筛选效果就很高。

至于热处理条件，由于芽孢的耐热性，会因培养条件不同而产生差异，所以应根据具体情况有所变化。

添加抑制剂•分离用的培养基，除控制营养，调节pH值外，还可添加一些专一性抑制剂，这样筛选效果还会提高。

例如在分离放线菌时，可先在土壤样品的悬浮液中加10%的酚数滴，以抑制分离时霉菌和细菌的生长。

添加一些抗菌素对某些微生物更有专一性的抑制，如分离酵母和霉菌，在培养基中添加一定量的青霉素、链霉素或新霉素以抑制细菌的生长。

•对不同菌类起抑制作用的抗菌素种类和浓度是有差异的。

一般的抑制剂对芽孢和孢子的作用力弱，对营养细胞的作用力强，所以也应区别分离对象，灵活添加。

•分离霉菌时，特别是菌丝蔓延的根霉、毛霉等，菌落有的很快连成一片，不易挑取单菌落。

若在培养基中添加去氧胆酸钠约0.1%左右，或山梨糖（在察氏培养基中加山梨糖0.1%，蔗糖0.01%），这样可防止菌丝蔓延，便于挑取。

控制培养温度•不同种类的微生物适宜生长温度是不同的。

一般嗜冷微生物最适温度在15℃左右，嗜温微生物在25-37℃，嗜热微生物在 55℃，甚至更高，除特殊要求外，我们筛选的主要是嗜温微生物。

（2）随机分离方法•有些微生物的产物对产生菌的筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离法进行分离。

4）生产性能的测定•分离后获得菌种才是筛选工作的第一步。

在菌种分离中，获得大量的各种菌株，虽然它们可能有一些共同的特点，但是只有进一步进行生产性能的测定，才能确定哪些菌株适合生产要求，可用于生产。

•一般分两步进行，即初筛和复筛，经过多次重复筛选直至获得1-3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验，并进而作为育种的出发菌株。

这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株。

以区别于人工育种方法得到的变异菌株。

生产性能测定的特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值和提取工艺等。

自然界中的一些微生物在一定条件下是产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其是与食品工业有关的菌种，更应慎重。

据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无需作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。

二、菌种选育•菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种，从而促进生产发展。

•菌种选育方法：自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程等。

•一般来说，优良的生产菌种应该具备如下的基本特征：•1、生产菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力；•2、在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其他产物；•3、生长繁殖能力强，有较强的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力；•4、能够高效地将原料转化为产品，这样可以降低生产成本，提高产品的市场竞争力；•5、有利用广泛来源原材料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较少；6、对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用；7、在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、降低成本有重要意义；8、具有抗噬菌体感染的能力；9、遗传特性稳定，这样才能保证发酵过程能够长期、稳定地进行，同时有利于实施最佳的工艺控制。

一）自然选育•在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变（Spontaneons Mutatition）而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。

•所谓自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。

•一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。

多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射。

互变异构效应是指四种碱基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式出现，平衡一般倾向于酮式和氨基式，因此，在DNA 双链结构中以AT和GC碱基对为主，在偶然情况下，T也会以稀有的烯醇式形式出现，在DNA 复制时，其相对的位置上就不出现A而是G。

自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。

另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。

自然选育在工业生产上的意义问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。

自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。

二)诱变育种•诱变育种：诱变育种就是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。

•诱变育种的理论基础：基因突变•突变：指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。

主要包括染色体畸变和基因突变。

•染色体畸变：指染色体或DNA片断的缺失、易位、逆位、重复等。

•基因突变：指DNA分子机构中的某一部位发生变化，又称点突变。

（一）诱变剂和诱变处理•1、物理诱变剂：如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子。

•物理因素中目前使用得最方便且十分有效的是紫外线。

紫外线诱变一般用菌（孢子）悬浮液进行处理，采用15W紫外线杀菌灯，波长为260nm左右。

灯与处理物的距离为30cm左右，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。

一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量以死亡率控制在70～80%为宜。

•紫外线的作用机制：主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体变异甚至死亡。

•其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。

2、化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。

化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。

1）氮芥氮芥是一种极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一般使用它的盐酸盐。

诱变机制：引起染色体畸变2）亚硝酸诱变机制：脱去碱基中的氨基3）N-甲基-N’硝基-亚硝基胍（NTG）亚硝基胍是亚硝基烷基类化合物的一种，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到12%-80%的营养缺陷型菌株，故有超诱变剂之称。

使用化学诱变剂的优缺点：1）大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。

2）化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。

而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。

3）大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用时必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。