GSH含量测定

GSH含量测定
一、原理
还原性谷胱甘肽(GSH)是植物细胞重要的抗氧化剂之一，是一个良好的表示氧化胁迫的指标。

GSH+TDBN在pH=7时生成黄色物质，其颜色深浅与GSH的浓度成线性关系。

即：在巯基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。

由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412 nm处具有最大吸收，DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。

二、材料、试剂、仪器
1、材料：小麦叶片
2、试剂
(1）GSH标准溶液：称取10mg 分析纯GSH，溶于蒸馏水中，并定容于10ml，即为1mg/ml 之标准母液，用稀释10倍（0.1mg/ml GSH）；
(2）5%偏磷酸；
(3）0.2mol/L 磷酸钾缓冲液，pH7.0；
(4）TDNB试剂：称取39.6mg二硫代双-二硝基苯甲酸（TDNB），用0.2mol/L磷酸钾缓冲液溶解并定容于100ml；
(5）1mol/L NaOH溶液。

2、仪器
（1）可见分光光度计：4台；（2）离心机：1台（10000转/分）；
（3）1/千天平-2台；（4）离心管：3支×16（10ml）
（5）刻度试管：4×16支；（10或15ml）
（6）普通试管（刻度试管）：7支×4（15*150 标准曲线）
（7）刻度吸管：0.5ml-8支； 1ml-8支; 2ml-16支; 5ml-8支；
（8）研钵：1×16个；（9）比色杯4套；（10）吸水纸适量；
（11）剪刀8把；（12）玻棒8支；
三、方法步骤：
1、制作标准曲线：取7支刻度试管，编号，按表加入试剂：
将上述溶液混合均匀，在室温下显色5min。

在412nm波长下测定吸光度。

以标准溶液中GSH浓度为X，吸光度为y，制作标准回归方程，（并求出GSH含量。

）
2 、样品测定：
称取植物鲜样0.204g加入少量5%偏磷酸研磨提取，并用5%偏磷酸定容到10ml。

10000rpm 离心10min。

离心后取上清液2 ml，同标准曲线操作。

重复三次。

3、结果计算：
用excel得到的回归方程为y=0.015255342x ,测得的样品吸光度值分别为y=0.204,0.204,0.202,带入得x=16.197ug/2ml。

GSH含量（μg/gFW）=(C×Vt )/ gFW =16.974*10／0.204=832.069μg/g 其中C=16.197，Vt=10ml,FW=0.204g。

C 为2ml 样品中GSH的含量（ug），FW为样品鲜重，Vt为样品总体积。

五、注意事项
1、GSH标准溶液要现用现配；
2、要学会正确使用分光光度计。