土壤脲酶活性的测定
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靛酚蓝比色法测定土壤脲酶的活性
一、实验原理
靛酚蓝比色法的基本原理是:被测物浸提剂中的NH4+,在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应,生成水溶性染料靛酚蓝,其深浅与溶液中的NH4+-N含量呈正比,线性范围为0.05~0.5mg/l之间。
靛酚蓝反应原理如下: NH3 + OCl——NH2 Cl +OH-
三、实验试剂
1) 10%尿素:称取10g尿素,用蒸馏水溶至100ml。
2)柠檬酸盐缓冲液(PH=6.7):184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并,用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升。
3)苯酚钠溶液(1.35mol/L):62.5克苯酚溶于少量无水乙醇,加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮,用无水乙醇稀释至100毫升(A),存于冰箱中;27克NaOH溶于100毫升水(B)。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合,用蒸馏水稀释至100毫升。
4)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。(9ml—100ml中)5)氮的标准溶液(0.1mg/ml):精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1ml含有0.1mg氮的标准液。
6)甲苯
四、实验过程
1.标准曲线的测定
吸取10ml氮的标准溶液定容至100ml,摇匀。从其中分别吸取0,1.00,3.00,5.00,7.00,10.00ml 13.00ml移至50ml比色管中,加水至20ml,再加入4ml苯酚钠的溶液,充分混合。紧接着加入3ml次氯酸钠,随加随摇匀,放置20分钟,用水稀释至刻度。将显色液在可见分光光度计上于578nm处,以1cm比色皿进行比色测定,以试剂空白为参比。以标准溶液氮含量为横坐标,以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
2.土样中脲酶活性的测定
分别称取2g过1mm筛的风干土样于50ml锥形瓶中,向其中加入1ml甲苯,以使土样全部湿润为宜。放置15分钟后,加入10ml 10%尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液(pH=6.7),并摇匀。将锥形瓶放入37℃恒温箱中,培养24h。培养结束后,用热至38℃水稀释至刻度,充分摇荡,并将悬液用滤纸过滤到锥形瓶中。
设置有土无基质对照,即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。相当于其他实验中所做的空白对照。
分别吸取(1-3ml)滤液于50ml容量瓶中,加蒸馏水至20ml,充分震荡,然后加入4ml 苯酚钠,充分混合,再加入3ml次氯酸钠充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度,溶液呈
现靛酚的蓝色(在1h内保持稳定)。在分光光度计上用1cm比色杯,于578nm处进行比色测定。
无土对照:不加土样,其他与实验同,以检验试剂忖度,整个实验设1个
无基质对照:以等提及水代替基质,其他与实验相同。
土壤脲酶活性以24小时1g土壤中NH3-N的毫克数表示。
注意事项:
1、每一个样品应该做一个无基质对照,以等体积的蒸馏水代替基质,其他操作与样品实验相同,以排
除土样中原有的氨对实验结果的影响。
2、整个实验设置一个无土对照,不加土样,其他操作与样品实验相同,以检验试剂纯度和基质自身分
解。
3、如果样品吸光值超过标曲的最大值,则应该增加分取倍数或减少培养的土样
四、结果计算:以24小时后1g土壤中NH3-N的毫克数表示土壤脲酶活性(Ure)。
Ure=(a样品-a无土-a无基质)×V×n/m
式中:a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数;
a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数;
a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数;
V为显色液体积;n为分取倍数,浸出液体积/吸取滤液体积;m表示烘干土重
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