脂肪来源干细胞免疫原性和免疫调节作用的实验研究_韩铮

收稿日期：2009-05-22作者简介：韩铮(1982-)，硕士，E-mail:allenhz520@脂肪来源干细胞免疫原性和免疫调节作用的实验研究韩铮，姜平，高建华，鲁峰，付冰川，陈晓炜（南方医科大学南方医院整形外科，广东广州510515）摘要：目的探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)在体外的免疫原性，以及ADSCs 在家兔同种异体皮片移植中的免疫调节作用。

方法将家兔淋巴细胞分别与自体和异体ADSCs 混合培养48h 后加入CCK-8试剂，并用酶标仪检测OD 值；在家兔同种异体移植皮片下注射自体ADSCs ，观察移植皮片的坏死时间，并于术后第7日切取移植皮片的周边组织进行组织学观察。

结果家兔淋巴细胞与自体、异体ADSCs 混合培养后用酶标仪检测OD 值分别为（1.527±0.402）和（1.615±0.351），两组OD 值差异无统计学意义；家兔同种异体移植皮片下注射ADSCs 的移植皮片的坏死时间为（7.170±1.472）d ，未注射ADSCs 的对照组移植皮片的坏死时间为（5.830±1.169）d ，两组皮片坏死时间差异具有统计学意义；术后第7日组织学观察见实验组皮下浸润的炎症细胞较少，皮下组织结构完整、清晰；对照组皮下浸润的炎症细胞较多。

结论脂肪来源干细胞在体外的免疫原性低，对家兔同种异体皮片移植有免疫调节作用。

关键词：脂肪来源干细胞；免疫原性；免疫调节；组织工程中图分类号：Q813文献标识码：A文章编号：1673-4254(2009)10-2144-03脂肪来源干细胞(ADSCs)是成体干细胞的一种，自Zuk 等［1］报道以来，以其来源广泛、取材简便的特点和可多向分化的潜能，成为干细胞及组织工程研究领域的热点［2］。

近年来有关ADSCs 的研究主要集中于其多向分化潜能［3-6］，而对其免疫学特性仍未展开较深入的研究。

本实验以家兔作为动物模型，对家兔ADSCs 的体外免疫原性及体内的免疫调节作用开展初步探讨，试为扩充组织工程种子细胞的来源及拓展ADSCs 的应用领域提供实验基础。

1材料和方法1.1实验动物与试剂健康新西兰大白兔10只，雌雄兼有，体质量2.0~2.5kg ，由南方医科大学SPF 级动物实验中心提供并饲养。

DMEM 高糖培养基，RPMI 1640培养基，胰酶，FBS （Hyclone ），Ⅰ型胶原酶，CCK-8试剂盒，Percoll 淋巴细胞分离液，PHA （植物凝集素）。

1.2方法1.2.1家兔ADSCs 的分离及体外培养取家兔腹股沟皮下脂肪5ml ，PBS 缓冲液反复冲洗后剪成约1mm 3大小的脂肪颗粒，0.1%胶原酶在37℃条件下消化30min 左右。

使用等量完全培养基（含10%FBS 的DMEM 高糖培养基）中和，离心（1200r/min ）5min 后去除上清，沉淀混悬后尼龙网过滤并接种于细胞培养瓶中，于37℃、5%CO 2孵箱培养。

于24h 后更换培养液，此后每3d 换液1次。

观察细胞生长情况，待6~7d 细胞生长融合达80%~90%后，0.1%胰酶消化后按1∶3进行传代培养。

1.2.2体外实验1.2.2.1家兔淋巴细胞的刺激增殖实验取家兔耳缘静脉血5ml ，用Percoll 淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出外周血淋巴细胞，计数后与PHA 混合培养于96孔培养板，具体实验分组如下，实验组：家兔淋巴细胞（1×104/孔）和PHA （100μg/ml ，20μl/孔）混合培养；对照组：单独家兔淋巴细胞培养组（1×104/孔）。

实验组与对照组各培养孔均培养48h 后加入CCK-8试剂（10μl/孔），继续混合培养4h 后用酶标仪检测培养板上各孔的OD 值。

1.2.2.2家兔ADSCs 体外免疫原性检测实验通过前述方法分离出家兔淋巴细胞，将其分别与自体ADSCs 和同种异体ADSCs 混合培养于96孔培养板，具体实验分组如下，对照组：家兔淋巴细胞（1×104/孔）和自体家兔的ADSCs （3×103/孔）混合培养；实验组：家兔淋巴细胞（1×104/孔）和同种异体家兔的ADSCs （3×103/孔）混合培养。

实验组与对照组各培养孔均培养48h 后加入CCK-8试剂（10μl/孔），继续混合培养4h 后用酶标仪检测培养板上各孔的OD 值。

1.2.3体内实验家兔10只，随机分成5组（记为A 、B 、C 、D 、E 组），每组2只互为同种异体皮片移植对象。

在每只家兔的两侧臀部设计直径为3cm 的圆形皮片，切取后组内、同侧之间交互移植。

实验组（左侧臀部）：皮片移植的同时在皮片下注射含自体ADSCs （1×106/kg ）的完全培养基2ml ；对照组（右侧臀部）：皮片移植的同时在皮片下注射不含自体ADSCs 的完全培养基2ml 。

术后每天观察各组家兔臀部移植皮片的存活情况并记录移植皮片的坏死时间（移植皮片红润，质地柔软，视为皮片存活良好；若皮片变为暗褐色且质地坚硬的面积>2/3，视为皮片坏死），于术后第7日将C 组和E 组两组家兔的实验组及对照组移南方医科大学学报(J South Med Univ)2009;29(10)2144··图3家兔同种异体移植皮片周边的组织学观察(术后第7天，HE 染色×200）：实验组（图A 和图C ）可见皮下浸润的炎症细胞较少,皮下组织结构完整、清晰；对照组（图B 和图D ）可见皮下浸润的炎症细胞较多图1ADSCs 的细胞形态观察（A 图为第3代细胞的第1天，B 图为第3代细胞的第3天，倒置相差显微镜×200）AB植皮片周边组织（移植皮片周边0.5cm 范围内组织）取材予切片并HE 染色，进行组织学观察。

1.2.4统计学处理应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示，体外家兔淋巴细胞的刺激增殖实验和家兔ADSCs 体外免疫原性检测实验中测定的OD 值采用两样本t 检验进行实验组和对照组的比较，体内实验皮片坏死时间采用配对样本t 检验进行实验组和对照组的比较，以P <0.05为差异具有统计学意义。

2结果2.2家兔ADSCs 的分离及体外培养经胶原酶消化后的原代ADSCs 培养48h ，第1次换液除去未贴壁细胞，大部分贴壁细胞呈宽大扁平的成纤维细胞样细胞。

ADSCs 培养至6~8d 后可形成较致密的细胞层，覆盖80%~90%的培养瓶，经胰酶消化后按1∶3传代，细胞生长速度较原代细胞明显增快，3d 后ADSCs 即可覆盖约80%的培养瓶（图1）。

2.2体外实验家兔淋巴细胞的刺激增殖实验中，培养板上各实验孔在加入CCK-8试剂4h 后用酶标检测仪测得的OD 值：实验组OD 值为1.853±0.500；对照组OD 值为0.563±0.298。

实验组与对照组的OD 值存在显著性差异（两样本t 检验，P <0.05）。

家兔ADSCs 体外免疫原性检测实验中，培养板上各实验孔在加入CCK-8试剂4h 后用酶标检测仪测得的OD 值：实验组OD 值为1.615±0.351；对照组OD 值为1.527±0.402。

实验组与对照组OD 值的差异无统计学意义（两样本t 检验，P >0.05）。

2.3体内实验实验组移植皮片的坏死时间为7.170±1.472d ，对照组移植皮片的坏死时间为5.830±1.169d ，实验组与对照组移植皮片存活时间的差异具有统计学意义（配对样本t 检验,P <0.05）；术后第7天的组织学观察可见：实验组皮下浸润的炎症细胞较少，皮下组织结构完整、清晰；对照组皮下浸润的炎症细胞较多。

图2家兔同种异体皮片移植模型(家兔双侧臀部，皮片直径=3cm)ABA B C D3讨论骨髓间充质干细胞(BMSCs)是间充质干细胞中最早被发现的具有多向分化潜能的成体干细胞，并长期应用于干细胞和组织工程学研究领域。

ADSCs 同样拥有和BMSCs 相似的表面标志，仅表达中等水平MHC-Ⅰ类分子［8］，不表达MHC-Ⅱ类分子和B7-1、B7-2、CD40、CD40L 等协同共刺激分子，导致T 细胞的无反应性而促成免疫耐受。

尹烁等［9］研究显示，即便在γ-干扰素的作用下，ADSCs 在体外仍不能明显刺激淋巴细胞的增殖。

另一方面，Niemeyer［10］在ADSCs 和淋巴细胞的混合培养液中检测到了高过正常浓度的转化生长因子β（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF ）和白介素10（IL-10）等有免疫抑制作用的细胞因子，提示ADSCs 在体外受淋巴细胞刺激后可能通过分泌以上细胞因子发挥免疫调节作用。

Ivan ［11］还报道ADSCs 与B 淋巴细胞混合培养后能明显影响后韩铮,等.脂肪来源干细胞免疫原性和免疫调节作用的实验研究第10期2145··者的抗体分泌。

本研究通过体外和体内实验进一步探讨ADSCs 的免疫原性和免疫调节作用。

在体外实验中，家兔淋巴细胞的刺激增殖实验结果证实了分离的家兔淋巴细胞活性正常，刺激后可显著增殖。

在此基础上，通过检测淋巴细胞受到家兔同种异体ADSCs 刺激后的增殖程度，并与等量的自体ADSCs （与淋巴细胞来自同一个体）作比较，来探讨ADSCs 在体外的免疫原性，结果显示ADSCs 在体外并不能引起异体淋巴细胞的显著增殖，证实了ADSCs 在体外的低免疫原性。

以往的研究多采用放射性核素标记法检测淋巴细胞增殖程度，本实验所采用的cck-8酶标仪检测法较之前者具有操作简便、无污染等优点；实验中选用自体ADSCs 作对照，较之高免疫原性刺激物如PHA 等，更有针对性地证实了ADSCs 的低免疫原性。

在家兔同种异体移植皮片下注射ADSCs ，观察移植皮片的坏死时间并进行组织学观察，结果显示皮下注射ADSCs 可明显延长移植皮片的坏死时间；移植皮片下未注射ADSCs 的对照组较之实验组，皮下组织内浸润的炎症细胞较多，提示ADSCs 在体内有免疫调节作用。

本实验所采用的皮下注射法，较之静脉注射法，可局部聚集更高浓度的ADSCs ，更有利于ADSCs 发挥作用。

通过淋巴细胞刺激增殖实验和同种异体皮片移植的动物实验，本研究进一步证实了ADSCs 与BMSCs 有相似的低免疫原性和免疫调节作用。

由于来源广泛、取材方便等优点，ADSCs 在干细胞和组织工程学研究领域具有更为广阔的应用前景。

但是，ADSCs 免疫学研究尚处于初级阶段，对于如何有效控制其在体内定向分化、迁移并整合参与宿主细胞组织功能还有待深入的探讨。

参考文献：［1］Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage cells from humanadipose tissue:implications for cell-based therapies ［J ］.Tissue Eng,2001,7(2):211-28.［2］Zuk PA ,Zhu M.Human adipose tissue is a source of multipotentstem cells ［J ］.Mol Biol Cell,2002,13:4279-95.［3］Erickson GR,Gimble JM,Franklin DM,et al.Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo ［J ］.Biochem Biophys Res Commun,2002,290:763-9.［4］Planat-Benard V,Menard C,Andre M,et al.Spontaneouscardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells ［J ］.Circ Res,2004,94:223-9.［5］Planat-Benard V,Silvestre JS,Cousin B,et al.Plasticity of humanadipose lineage cells toward endothelial cells:physiological andtherapeutic perspectives ［J ］.Circulation,2004,109:656-63.［6］Safford KM,Hicok KC,Safford SD,et al.Neurogenic differentiationof murine and human adipose-derived stromal cells ［J ］.Biochem Biophys Res Commun,2002,294:371-9.［7］Bartholomew A,Sturgeon C,Siatskas M,et al.Mesenchymal stemcells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo ［J ］.Exp Hematol,2002,30:42-8.［8］Puissant B,Barreau C.Immunomodulatory effect of human adiposetissue-derived adult stem cells:comparison with bone marrowmesenchymal stem cells ［J ］.Br J Haematol,2005,129(1):118-29.［9］尹烁,崔磊,杨平,等.脂肪干细胞免疫学性状的初步实验观察［J ］.组织工程与重建外科,2006,1:38-44.［10］Niemeyer P,Kornacker parison of immunological propertiesof bone marrow stromal cells and adipose tissue-derived stem cells before and after osteogenic differentiation in vitro ［J ］.Tissue Eng,2007,13(1):111-21.［11］Ivan Bochev,Gabriel Elmadjian.Mesenchymal stem cells fromhuman bone marrow or adipose tissue differently modulate mitogen-stimulated B-cell immunoglobulin production in vitro ［J ］.Cell Biol Int,2008,32:384-93.南方医科大学学报(J South Med Univ)第29卷2146··。