流式细胞术的原理及临床应用

流式细胞术的原理及临床应用

马洪星1　张春斌2　汪晶冰1　庞玉军1　张丽岩2　

(1.黑龙江省大庆油田总医院检验科,163001　2.黑龙江省佳木斯大学基础医学院生物教研室)中图分类号:　R331 文献标识码:A 文章编号:1006-9534(2003)04-0145-02

流式细胞术(flow cytometry)是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析的一种新技术,它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以同时测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了一个全新视角和强有力的手段。目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,在细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等领域内发挥着重要作用[1]。

一、流式细胞仪检测的原理[2,3]

流式细胞仪主要包括以下几个组成部分:激光系统、流动系统、信号处理及放大的系统、计算机系统。当待测标本被制成单细胞悬液,经染色后进入流动室,流动室充满流动的鞘液,鞘液压力与样品流压力是不同的,当两者的压力差异达到一定程度时,鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。若将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料,那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受激发产生特定波长的荧光,通过一系列信号转换、放大、数字化处理、就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料,可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征,如果对具有某种特征的细胞有兴趣,还可以利用流式的分选功能将其分选出来,以便进一步培养、研究。

二、流式细胞仪在免疫学中的应用[4]

(1)淋巴细胞亚群分析:淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群,在免疫应答过程中,末梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群。各亚群的数量和功能发生异常时,就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化。FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原,将不同的淋巴细胞亚群(包括CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+)区分开来,并计算出CD4+/CD8+的比例,可通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定来监控患者的免疫状态,指导治疗。

(2)感染及其疗效观察:由于T淋巴细胞在人体的免疫系统中承担着重要功能,因此当感染发生时,T淋巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反映感染的状态和程度。当病毒感染发生时(如乙型肝炎.EB病毒和巨细胞病毒)CD8+细胞增多,对CD8+T细胞测定有助于对感染的诊断、治疗效果的动态观察。

(3)流式细胞仪可以对器官移植和骨髓移植后的患者进行监控。当患者CD3+、、CD25+持续增加提示已开始发生排异,CD4/CD8持续下降,表明有感染发生,当其比值小于012时必须停用免疫抑制剂。

(4)免疫性疾病分析:SL E患者的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况和器官侵犯程度,活动或非活动性伴有多系统疾病,但无肾脏损害的患者可出现CD4/CD8T比值增高,伴有严重肾脏损害的SL E患者可出现低CD4+。高CD8+的现象。

(5)利用流式细胞术检测阵发性睡眠性血红蛋白尿(PHA),根据血细胞的细胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂(GPI)所连接的蛋白,如DFA(CD55)与MIRI(CD59),来确诊此病,比传统的血清溶血试验具有更高的特异性与敏感性。

(6)HLA群体分析:FCM运用HLA-B27特异性单克隆抗体检测抗原,其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高,有助于强直性脊柱炎的辅助诊断。

(7)AIDS中的应用:用于CD4+细胞的绝对计数(CD4+阳性细胞是HIV病毒特异侵染细胞),另外还可以监测病程和治疗过程中患者的免疫状态,估计预后。

三、FCM在细胞生物学中的应用

(1)细胞周期分析

在细胞周期内,DNA含量随时相发生周期性的变化。通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定,可分析细胞周期各时相细胞的百分比,周期动力学参数以及DAN异倍体。

(2)可利用与钙离子特异结合的荧光染料和激发光谱或发射光谱是p H值依赖荧光染料进行细胞内钙离子浓度测定和细胞内p H值测定。

四、FCM在肿瘤中的应用

(1)肿瘤诊断

DNA非整倍体的出现是癌变的一个重要标志。细胞的增值能力大小也可反映肿瘤的生物学特征。因此临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍体分析。辅助肿瘤诊断,包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面[5]。

(2)肿瘤预后估计

异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道,在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中,异倍体和/或较高的S期比率都是不良的预后标志。同样地,在肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中,亦有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分期等指标基础上,用流式细胞仪监测肿瘤

DNA倍体可更客观地预测预后。

(3)监测癌基因和抑癌基因表达在肿瘤发生发展过程中的作用

用流式细胞仪可以通过特异性的单克隆抗体监测肿瘤细胞中癌基因表达产物的水平以研究肿瘤调控因素。如有文献报道,p53蛋白在乳腺癌细胞中的表达与肿瘤的预后有关。而ras基因的产物P21蛋白的表达从萎缩性胃炎、癌前病变、胃癌依次增加,证实P21蛋白在癌变过程中起着重要作用。

五、流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用[6]

传统的光镜和电镜技术研究细胞凋亡不能进行定量,并且不能对单细胞进行分析。FCM对细胞凋亡进行分析和检测是目前应用较多的方法,结合荧光染色,可对单细胞做多参数分析,尤其适合于分析淋巴细胞、血细胞、骨髓细胞、培养细胞等。FCM除可定量监测凋亡细胞数和凋亡指数外,可同时测定凋亡细胞发生于某个特定的细胞周期;可同时测定细胞的增值率与死亡率,从而了解肿瘤细胞的生长/死亡速率,早期测知药物疗效。FCM的优势还在于可将凋亡和坏死区分开来。

FCM可用来测定单细胞为基础的凋亡细胞膜的早期改变,如由于磷脂不对称性丢失导致磷脂酰丝氨酸(PS)暴露于细胞膜的外面;测定单细胞为基础与凋亡相关的各种基因蛋白表达如Bcl-2、Bax、ICE、c-myc、ras、p53、cyclin、TNF、Fas 等,以探讨凋亡分子机制与凋亡细胞周期的关系;还可测定线粒体膜电位的改变。

六、FCM在药理学中的应用

多重耐药性(multidrug resistance,MDR)MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白(P-gp)亲脂化合物,包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排除荧光染料与细胞内P-gp的含量直接相关。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时,患者对化疗药物开始出现耐药性,需要考虑其他治疗方式。

七、流式细胞仪在血小板功能评价方面的应用

血小板糖蛋白(GP)是参与止血、血栓形成的重要分子基础,这些膜糖蛋白是一类重要的黏附分子。用GP单克隆抗体对血小板进行免疫荧光标记,用FCM分析单个血小板或血小板亚群,是血小板膜糖蛋白检测分析方法的重大发展,该方法简便、快速、标本用量少,灵敏度高,结果准确。与血小板有关的抗原的临床意义有:

(1)诊断遗传性血小板功能缺陷疾病:巨血小板综合征(BBS)患者血小板CD42a/CD42b复合物先天缺陷,FCM中表现CD42a与CD42b不仅严重缺乏,而且其平均荧光强度显著低于阴性对照,CD61代偿性增加。血小板无力症(GT)患者FCM表现血小板GPII b、GPIIIa(CD41、CD61)明显缺乏,CD42a和CD42b基本正常或稍高,并可出现异常血小板亚群。

(2)血栓性病与血栓前状态:由于活化血小板是血栓的主要成分之一,也是引起血栓形成的主要原因,所以血小板活化程度的增高与疾病的发生发展有关。CD62p和CD63是血小板活化最特异和灵敏的分子标志物,正常人只有低水平活化,外周血CD62p只有3%～5%。

八、FCM在分子生物学中的应用

流式细胞术是细胞分析领域的最好手段,同时FCM分选系统可为PCR、FISH等技术提供纯度高的特异细胞群。

随着流式细胞术相关技术的发展,该技术对基础医学和临床医学的影响将越来越深远。

九、流式细胞术在优生遗传领域中的应用

上世纪,一些学者相继证实母血循环中存在胎儿细胞,应用流式细胞术可使其中含量极微的胎儿有核红细胞得到富集,因为有核红细胞含有胎儿的全部基因,并具有不影响多胎妊娠等优点,结合FISH,PCR等技术,使之具有应用于无创性产前诊断的广阔前景。

参　考　文　献

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2000,(光盘的流式细胞术部分)

[2]左连富,等.流式细胞术与生物医学[J].辽宁科学技术出版社,

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[3]李家增,等.血液实验学[J].上海科学技术出版社,1997:530-

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[4]龚非力,等.基础免疫学[J].湖北科学技术出版社,1998:10-26

[5]Frankfurt OS,Rob JA,et al.Monoclonal antibody to ainggle-

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[6]Reed J.Applications of apoptosis programmed cell death[M].La

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收稿日期:2002-05-12

(上接第107页)

Intrauterine contraception in the year2001:can intrauterine device use be revived with new improved contraceptive technology[J]?Eur J Contracept Reprod Health Care,2000,5(4):295-304

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[5]Hyder SM,Stancel GW.Regulation of angiogenic growth factors in

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收稿日期:2002-10-18