细胞凋亡

hoechst33258染色，细胞核会呈 致密浓染，或呈碎块状致密浓染。
（3）电子显微镜观察法
可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质 固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞 质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽” 及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞 噬现象。
2. 生化特征检测
• 细胞凋亡最显著的生化特征是ca2+、 Mg2+依赖的内源性核酸酶激活后，将细 胞核染色体从核小体间断裂，形成约为 180-200bp或其多聚体组成的寡核苷酸 片段。
结果判断：正常细胞核染成蓝色或蓝紫色，细胞浆染粉 红色，色泽均一。凋亡细胞可见核固缩、边集或碎裂， 染色变深，细胞膜皱褶、卷曲和出泡以及出芽形成的 凋亡小体。
（2）荧光显微镜观察方法
原理：凋亡细胞最突出的形态学变化 是染色体固缩，DNA广泛裂解后导致 核形态的变化。许多荧光复合物可嵌 入DNA分子或以静电作用与DNA分子 结合，可用作细胞DNA的荧光探针。 用DNA荧光探针染凋亡细胞DNA，可 在荧光显微镜下直接观察核形态学的 变化。
细胞凋亡的生物学意义
•在发育过程中清除多余的细胞 •清除已完成功能的细胞 •清除发育不正常的细胞 •清除正常生理活动过程中无用的细胞 •清除病理活动中有潜在危险的细胞
第一节
细胞凋亡的形态学特征
一、光镜下的形态学特征
凋亡细胞在
光镜下的形态 学特征表现为 核固缩、胞质 浓缩、细胞体 积急剧变小。
其中胞核变化 最为显著。
第二节 细胞凋亡的检测方法
1. 形态学检测 2. 生化检测 3. 流式细胞仪在细胞凋 亡检测中的应用
1. 形态学检测
形态学检测是鉴定细胞凋亡最可靠的方法 之一。主要是通过光学显微镜和电子显微镜 对组织或细胞进行各种染色。 （1）光学显微镜观察方法 （2）荧光显微镜观察方法 （3）电子显微镜观察方法
• 针对此寡核苷酸片段发展了检测凋亡的 琼脂糖凝胶电泳法、原位末端标记法和 ELISA法等，这些方法具有很高的特异 性和敏感性，为凋亡的研究提供了强有 力的工具和手段。
（1）普通光学显微镜观察方法
苏木素-伊红染色（HE染色） 原理：石蜡切片技术里常用的染色法之一 。苏 木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与 胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料， 主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。 易于被碱性或酸性染料着色的性质分别称为嗜 碱性和嗜酸性；若于两种染料的亲和力都不强， 则称中性。一般的组织变化和组织产物都可以 通过这一染色法显示出来。是形态学最常用的 染色方法。直到目前为止，病理组织学的基本 知识，绝大多数都是从观察HE染色标本中得来， 在质量较佳的HE染色切片上，各种组织或细胞 的一般形态结特点都可以观察到。
内质网明显扩张，扩张的内质网与细胞膜融合，在融合 处的细胞膜有火山口样的凹陷形成，有的形成大囊泡， 成为特征性的发泡现象。
同时质膜也明显卷曲、内折，包绕胞质成分和浓缩、碎 裂的核碎片，使整个细胞崩解成为一系列大小不等的有 质膜围绕的致密的凋亡小体。
少数凋亡小体有核物质，而其他凋亡小体只含有胞质的 成分。组织内凋亡小体形成后很快被附近的细胞识别、 吞噬和消化。
甲基绿-派诺宁染色
原理：细胞凋亡是一种细胞主动死亡的过程，需要有细 胞内蛋白酶的激活，细胞之内常有mRNA的表达增强。 而细胞坏死则是被动的细胞死亡过程，细胞质内常有 RNA的损失。应用甲基绿对DNA染色的特异性和派诺 宁对RNA的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核 糖核苷酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染 色者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞
研究简史
细胞凋亡概念的形成阶段 细胞凋亡的生物化学研究阶段 细胞凋亡的分子生物学研究阶段 细胞凋亡临床应用的基础研究阶段
细胞凋亡与其他学科的关系
与发育生物学的关系 与免疫学的关系 胸腺细胞成熟过程中的细胞凋亡现象 激活诱导的细胞凋亡 激活淋巴细胞对靶细胞的攻击 细胞凋亡在免疫应答的反馈性调节中发挥作用 细胞凋亡参与CTL和NK细胞的效应功能 与临床医学的关系 细胞凋亡与肿瘤 细胞凋亡与AIDS 细胞凋亡与自身免疫性疾病
细胞凋亡
医学病毒学研究所
刘媛媛
概论
细胞凋亡的概念 细胞凋亡的研究简史 细胞凋亡与其他学科的关系 细胞凋亡的生物学意义
凋亡是种自然现象
概念
细胞凋亡 (apoptosis ) 是在一定的生理或病理 条件下，一种由基因调控的细胞主动的死亡过程。
程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)，在一定时间内，细胞按一定的程序发生 死亡，这种细胞死亡具有严格的基因时控性和选 择性。
近年来有人认为，凋亡与坏死没有绝对的区别 界限，在一定的条件下凋亡可以转化为坏死。 在体外诱导凋亡的实验中发现，适量的诱导剂 可以诱导出细胞凋亡，继续增加诱导剂的用量 则诱导出坏死的改变。
在体内，如果凋亡小体不被识别，吞噬功能障 碍，不能及时清除凋亡小体，凋亡小体的完整 膜结构破坏后，内含的溶酶体释出，可引起组 织坏死。
AO-EB染色法
活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质 呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
Hoechst33258染色法/Hoechst33342染 色法
原理: Hoechst33258及Hoechst33342两者均 为特异性DNA染料，但在pH2.0环境下优先与 RNA结合
凋亡细胞DNA的电泳图
坏死与凋亡的区别
细胞坏死
细胞凋亡
死亡原因 外界伤害所致的被动 生理病理条件下由基因控
死亡
制的
死亡过程 膜通透性增高、细胞 质膜整合性好、核凝集、 溶解、早期核无变化 出现凋亡小体
死亡结局 引起严重的炎症反应。不伴有炎症反应、单个细 成群细胞丢失、瘢痕 胞丢失、不形成瘢痕 形成。
结果判断：光镜下细胞核呈 蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋 亡细胞在组织中单个分布， 表现为胞核深染，胞质浓缩， 染色质成团块状，细胞表面 有“出芽”现象。坏死组织 则呈匀质红染的无结构物质， 核染色消失。
台盼蓝染色
如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进 入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞 膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常 细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的 完整性，区别坏死细胞有一定的帮助
细胞凋亡中染色体裂解为DNA片段
细胞凋亡往往需要新的基因转录和蛋白质 合成， 因而需要能量。但是，有些细胞发 生凋亡时，染色质DNA并不降解，表明 DNA降解并不是细胞凋亡必不可少的内 容。而细胞坏死时没有新的基因表达和蛋 白质合成，不需要能量，DNA被随机降 解为任意长度的片段，在电泳时显示连续 的“涂片带”。
结果判断：在荧光显微镜下，活细胞呈弥散、微 弱、均匀的荧光，坏死细胞不被染色。出现细胞 凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒 块状荧光及明显核形态变化，如果见到3个或3个 以上DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞。该法利用 凋亡细胞对Hoechst摄取增强，由于不同细胞对 Hoechst摄取各异，不一定适合所有细胞。
②分隔机制 在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等 的分隔区，靠近细胞膜端的分隔膜与细胞膜融合并 脱落形成凋亡小体。
③自噬体形成机制 凋亡细胞内线粒体、内
质网等细胞器和其他胞质成分一起被内质网 膜包裹形成自噬体，自噬体在与凋亡细胞膜 融合后排出胞外形成凋亡小体。
有些细胞不形成若干个凋亡小体，而仅
仅发生核固缩和胞质浓缩，成为单个致密的 结构，这也被称为凋亡小体。在病毒性肝炎 中见到的嗜酸性小体就是凋亡小体的例子。
细胞凋亡从启动到凋亡小体被吞噬最短的仅需 数分钟，而凋亡小体被吞噬细胞吞入后几小时 才被消化成残余体，因此实验中经常见到的是 凋亡小体被吞入后进行消化降解的第2阶段。
三 、 凋亡小体的形成机制
①发芽脱落机制 凋亡细胞内聚集的染色质块形成大 小不等的核碎片后，整个细胞通过发芽(by budding)、起泡(by zeiosis)等方式形成一个个球 形突起，并在根部缩窄脱落，形成一些大小不等、 内含胞质、细胞器以及核碎片的膜性小体，即凋亡 小体。
细胞凋亡与细胞坏死的形态学比较
凋亡的生化反应
主要是细胞核的DNA被核酸内切酶在核小 体单位之间降解，产生若干大小不一的寡 核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现 DNA“梯形带”，这些区带由180~200个碱 基对整数倍的寡核苷酸片段组成。
核小体上的DNA双链长度为140bp，核小体之间是 长度为50~60bp的DNA链和组蛋白H1组成的连接区。 核小体和连接区组成核心核小体亚单位，总长度为 180~200bp。 在凋亡时核酸内切酶活化，在连接区特异性切断 DNA链，因此形成的DNA片段的长度总是核心核小 体亚单位DNA长度， 180~200bp整倍数，这个长度 即是核小体重复单位的大小。
四、细胞凋亡与细胞坏死
细胞凋亡和细胞坏死是多细胞生物中细胞死亡 的两种不同形式，它们在多方面有着本质的区 别： 形态学 分子机制 生物学意义
凋亡细胞的形态学特征
细胞体积缩小，核染色质浓缩、凝集，常 呈新月形，胞浆浓缩，线粒体无大变化， 内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，细胞 膜内陷将细胞自行分割为多个具有完整膜 性结构、内含各种细胞成分的凋亡小体。
细胞凋亡与PCD的区别
1. PCD侧重于功能方面，凋亡则是形态学方 面的含义，通常人们未加以严格区分而等 同使用
2. PCD主要由细胞凋亡引起，但可能由多种 机制引发。同样细胞凋亡既有PCD部分， 又有肺程序部分存在
3. PCD仅存在于发育细胞中，而细胞凋亡即 可存在于发育细胞中，亦可存在于成体细 胞中
吖啶橙染色法
原理：吖啶橙的荧光为绿色，随pH值下降可变为 橙红色。吖啶橙与RNA和DNA通过两个部位结合。 pH值6.0时，DNA结合染料聚合加速，低于3.8 时，聚合受抑制，但RNA在pH值6.0和3.8时都 能聚合，使颜色变红。
结果判断：在荧光显微镜下细胞核DNA为黄色或 黄绿色荧光，细胞质和核仁RNA为橘黄色或橘红 色荧光。出现凋亡时，细胞核或细胞质内可见致 密浓染的黄绿色染色。细胞坏死时，细胞质内黄 绿色或橘黄色荧光均可减弱或消失。将吖啶橙与 溴化乙锭结合做凋亡细胞的检查，因为EB不能透 过正常活细胞，所以可区分坏死和凋亡。
由于凋亡小体具有完整的膜结构，不出现 溶酶体酶等细胞内涵物外泄，故不引起炎 症反应和次级损伤。 ·
细胞坏死的形态学特征
膜通透性增加，细胞外形发生不规则变化， 内质网扩张，核染色质不规则位移，进而 线粒体及核肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破 裂，细胞质的内容物外溢，引起严重的炎 症反应。坏死的细胞常常是成群的细胞一 起丢失。
凋亡细胞：凋亡细胞与邻近细胞分离
二、细胞凋亡在电镜下的形态学特征
在光学显微镜下Leabharlann Baidu常规方法判断细 胞凋亡比较困难，而超微结构观察 则可显示凋亡细胞的许多特征。到 目前为止，超微结构改变仍为确定 细胞凋亡发生的最可靠的方法之一。
(一)透射电镜观察
在透射电镜下发现凋亡细 胞核的变化发生较早，染 色质迅速浓缩，常形成致 密的新月形帽状结构，附 着于核膜下。附着区核孔 消失，核仁分解为许多嗜 锇酸的细小颗粒，分布于 核的中央。随后，核发生 碎裂。细胞表面的特殊结 构如微绒毛、细胞连接等 减少甚至完全消失。胞质 浓缩，但细胞器的结构仍 保留。线粒体和核糖体的 结构完整。
结果判断：镜下凋亡细胞固缩，细胞核呈绿色或者蓝绿 色着染，胞质呈紫红色着染，坏死细胞只有细胞核呈绿 色着染。
Giemsa染色
一般用于血液和造血组织来源的细胞或白血病细胞的染 色。
原理：吉姆萨染液由天青，伊红组成。嗜酸性颗粒为碱 性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色；细胞核 蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青 结合，染紫蓝色，；中性颗粒呈等电状态与伊红和美 蓝均可结合，染淡紫色。
(二)扫描电镜观察
在扫描电镜下，凋亡细胞显示细胞体积缩小，微绒毛减少或消 失。部分细胞表面出现单个或多个泡状突起，常位于细胞的一 侧，且大小不等，有的球形小体与胞体间连接变窄。用蚀刻法 显示核孔分布异常，其全部移到染色质疏松部位，染色质浓缩 部位核孔消失。
超微结构的变化
可分为2个阶段
第1阶段为细胞核固缩、细胞质浓缩及凋亡小体 形成； 第2阶段是凋亡小体被其他细胞吞噬和降解。