环介导等温扩增技术
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环介导等温扩增技术
胡星星 20150511 2015.10.20
主要内容
• • • • 定义 原理 操作步骤 优缺点及
定义
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是指在等 温（60-65℃）条件下，利用链置换DNA聚 合酶短时间（通常<1h）内进行核酸扩增， 是一种“简便、快速、精确、低价”的基 因扩增方法。 其检测结果可直接肉眼观察白色沉淀 或者绿色荧光，是一种适合现场、基层快 速检测的方法。
原理
扩增启动阶段
循环扩增阶段
延伸循环阶段
扩增启动阶段
FIP F3
（5）:有1个环状构造（Fc1末端5’端游离） 的单链
BIP
B3
（8）:有2个环状构造（F1末端即3’端游 离和Bc1末端即5’端游离）的单链
循环扩增阶段
• FIP
F1末端延伸至形成一个环状构造（B1末端即3’端游 离）；FIP 退火到茎环结构（8）上，引导链置换DNA 合 成反应，产生结构（9）的产物；随后产物（9）的B1末 端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物(10） 和茎环结构（8’）（与开始的产物（8）序列互补的）；
•
产物(10)和(10’)进入延伸循环步骤，分别 形成(11)和(11’)；内部引物又可以(11)和(11’) 作为模板，引导链置换DNA 的合成，使产物的序 列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些 具有不同茎长度茎环结构的DNA 和带有许多环的 折叠结构的DNA 的混合物。
LAMP法实验室常规操作步骤
wenku.baidu.com
应用
LAMP 技术因其快速、高效、特异、灵 敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄 生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领 域，并且还将广泛应用于临床诊断、环境 监测、食源安全等领域，具有更为广阔的 发展应用前景。
抽取、提纯样本DNA或RNA
环介导等温扩增技术（LAMP）法扩增
实时浊度检测或目视检测绿色荧光
优缺点
• 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）； 反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需 要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操 作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、 酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左 右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。 • 缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在 进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应 后的反应管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因 可能不适合使用环介导等温扩增方法。
• BIP
B1末端延伸至形成一个环状构造（F1末端即3’端游 离）；BIP 退火到茎环结构（8’）上，引导链置换DNA 合成反应，产生结构（9’）的产物；随后产物（9’）的 F1末端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物 (10’）和茎环结构（8），产物（ 8 ）开始新一轮的循环 扩增。
延伸循环步骤
胡星星 20150511 2015.10.20
主要内容
• • • • 定义 原理 操作步骤 优缺点及
定义
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是指在等 温（60-65℃）条件下，利用链置换DNA聚 合酶短时间（通常<1h）内进行核酸扩增， 是一种“简便、快速、精确、低价”的基 因扩增方法。 其检测结果可直接肉眼观察白色沉淀 或者绿色荧光，是一种适合现场、基层快 速检测的方法。
原理
扩增启动阶段
循环扩增阶段
延伸循环阶段
扩增启动阶段
FIP F3
（5）:有1个环状构造（Fc1末端5’端游离） 的单链
BIP
B3
（8）:有2个环状构造（F1末端即3’端游 离和Bc1末端即5’端游离）的单链
循环扩增阶段
• FIP
F1末端延伸至形成一个环状构造（B1末端即3’端游 离）；FIP 退火到茎环结构（8）上，引导链置换DNA 合 成反应，产生结构（9）的产物；随后产物（9）的B1末 端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物(10） 和茎环结构（8’）（与开始的产物（8）序列互补的）；
•
产物(10)和(10’)进入延伸循环步骤，分别 形成(11)和(11’)；内部引物又可以(11)和(11’) 作为模板，引导链置换DNA 的合成，使产物的序 列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些 具有不同茎长度茎环结构的DNA 和带有许多环的 折叠结构的DNA 的混合物。
LAMP法实验室常规操作步骤
wenku.baidu.com
应用
LAMP 技术因其快速、高效、特异、灵 敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄 生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领 域，并且还将广泛应用于临床诊断、环境 监测、食源安全等领域，具有更为广阔的 发展应用前景。
抽取、提纯样本DNA或RNA
环介导等温扩增技术（LAMP）法扩增
实时浊度检测或目视检测绿色荧光
优缺点
• 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）； 反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需 要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操 作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、 酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左 右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。 • 缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在 进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应 后的反应管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因 可能不适合使用环介导等温扩增方法。
• BIP
B1末端延伸至形成一个环状构造（F1末端即3’端游 离）；BIP 退火到茎环结构（8’）上，引导链置换DNA 合成反应，产生结构（9’）的产物；随后产物（9’）的 F1末端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物 (10’）和茎环结构（8），产物（ 8 ）开始新一轮的循环 扩增。
延伸循环步骤