大肠杆菌疫苗的制备

大肠杆菌灭活苗的制备

实验原理

致病性大肠杆菌是人和多种动物（猪、鸡等）的致病菌之一。疫苗免疫是控制大肠杆菌病的主要方法。从动物体分离或实验室保存鉴定的大肠杆菌菌株，经扩增培养，配制成适当浓度，用甲醛灭活，使大肠杆菌失去毒力但又保持免疫原性，制成灭活疫苗。在疫苗中添加白油佐剂，有利于增强疫苗的免疫效果。

甲醛是最古老常用的灭活剂，现在我国用的26种灭活疫苗，均以甲醛为灭活剂。性质：甲醛为刺鼻的气体，水溶液叫福尔马林，浓度为36%-40%。10°C 以下易聚合成三聚甲醛或多聚甲醛，为白色沉淀。甲醛的醛基起灭活作用，可使蛋白质的氨基→羟甲基胺；羧基→亚甲基二醇单酯；羟基→羟甲基酚；巯基→硫代亚甲基二醇。浓度：需氧菌甲醛浓度到0、1%--0、2%，厌氧菌0、4%--0、8%，病毒0、05%--0、4%，原则是浓度低，时间短，温度低可以灭活细菌，尽量减少破坏抗原（通常加入量，以福尔马林量计算，不再折合甲醛浓度）。

乳化剂是一种降低其它溶液表面张力作用的物质，可使一种物质分散混合于另一不相容的液体中。司本80或吐温80是乳化剂，他们可使油类和水剂疫苗乳化均匀。疫苗水剂是分散相（内相），油类为连续相（外相），两者中间是乳化剂，可以做成油包水，W/O；也可以做成水包油，O/W；前者不易吸收，储存时间长。后者容易吸收和释放。

实验目的

1、掌握细菌性疫苗的灭活原理与方法

2、掌握疫苗的乳化原理与方法

3、掌握细菌性疫苗的制备方法

实验器材与试剂

分光光度计、超净台、离心机、组织匀浆器、恒温培养箱、培养皿、涂布器、棉签、三角烧瓶

试剂：牛肉膏培养基、生理盐水、大肠杆菌、甲醛、白油、司班-80

菌种分离与鉴定（略）：本试验室保存。

细菌的扩大培养：将菌种均匀涂抹于营养琼脂平板表面，37℃培养18～24h，以灭菌生理盐水洗下所有培养物，置灭菌三角瓶中。

油乳剂苗的制备

（1）灭活：取细菌培养液，以灭菌生理盐水稀释至含细菌总数为150亿/mL （比浊法测定OD600>1×109）.加入菌液体积0.4%的福尔马林，于37℃恒温条件下灭活48h，其间每隔4～5h摇振一次。

（2）油相制备：将白油加热至50～60℃，加入6％司番-80，不断搅拌、混匀；

（3）乳化：将油相加入烧杯中电动搅拌，缓慢加入水相(油相︰水相为2:1)，逐渐增大搅拌速度，在组织搅拌机下以10000～12000r/min搅拌3min，停2min，重复3次，将菌苗分装。

（4）外观检测：观察疫苗的外观；

（5）稳定性检测：将疫苗置离心管中，3500r/min离心15min，观察有无分层或破乳；

（6）剂型检测：将疫苗滴于冷水表面，不分散为油包水型，分散则为水包油型；粘度检查:用出口内径为1.2mm的1mL吸管在常温下吸满1mL疫苗后垂直放出0.4mL所需时间为疫苗的粘度单位。

无菌检验：取适量灭活苗，接种于肉汤培养基上，置37℃，培养3d后，吸取培养物，观察有无细菌生长。

（7）安全性检查（略）油苗深部肌肉接种3只18日龄健康雏鸡(1mL／只)，3只120日龄成鸡(2mL／只)，观察有无不良反应。

（8）免疫保护试验（略）将油苗分别接种到10只18日龄非免疫健康雏鸡，0．5mL／只，同时设对照组3只，不作免疫。接种前与接种后7．14、21、28、42、56d采血，用试管凝聚法检测抗体，免疫14d后用制苗菌液(0．1mL／只)攻毒。

实验报告

实验结果：各个实验步骤的结果总结

思考题

1、灭活和乳化过程有哪项注意事项？

2、如何评价疫苗效果？