质粒提取、定量和酶切鉴定

共价闭环超螺旋DNA＞线性DNA＞开环的双链环状DNA
质粒提取、定量和酶切鉴定
琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％）
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线性DNA分子大小 （kb） 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3
本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶 质粒提取、定量和酶切鉴定
溶液S1： 50 mmol/L 葡萄糖 10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 2毫克/毫升 溶菌酶
裂解液S2：200 mmol/L NaOH 1% SDS
中和液S3：3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液
质粒提取、定量和酶切鉴定
1. 收集细胞
12000rpm
1.5mL 菌液
菌体沉淀
1 min
实验流程
3. 裂解细胞
2. 悬浮细胞
250μl
250μl
剧烈震荡
溶液S1
裂解液S2
颠倒混匀4-6次
室温静置 3~5min
4. 中和 350μl 中和液S3
5. 过柱分离
温和地 颠倒混匀6-8次
12，000rpm 10 min
取600μl上清至
吸附柱管
至出现白色
12，000rpm
•影响酶切反应的因素
底物DNA的纯度 反应系统：(反应缓冲液) 反应体积： 甘油浓度<5% 保温时间与温度
质粒提取、定量和酶切鉴定
四、琼脂糖凝胶电泳
质粒提取、定量和酶切鉴定
电泳：带电粒子在电场中泳动的现象
影响迁移率的因素？
电场 大小（分子量）
样品： 形状（构型）
电荷
质粒DNA三种构型：
共价闭环超螺旋 线性 开环的双链环状
质粒提取、定量和酶切鉴定
实验材料
• 大肠杆菌DH5a菌株 • pMD18-T载体 • 易瑞质粒小量提取试剂盒
• Takara EcoRI 限制性内切酶 • Takara Hind III 限制性内切酶 • Takara 10 × M 酶切缓冲液
• BioWest电泳琼脂糖干粉 • 0.5×TBE核酸电泳缓冲液 • EB 核酸荧光染料 质粒提取、定量• 和酶Ta切k鉴ar定a 6 × 电泳上样缓冲液
质粒DNA的提取、定量 与酶切鉴定
Extraction and Identification of Plasmid DNA
质粒提取、定量和酶切鉴定
实验流程图
一、碱裂解法提取质粒
二、质粒定量
最后做
三、质粒酶切
பைடு நூலகம்
四、酶切产物的琼脂糖电泳检测
质粒提取、定量和酶切鉴定
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定DNA的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
• 碱裂解法； • 煮沸裂解； • 羟基磷灰石柱层析法； • 质粒DNA释放法； • 酸酚法等
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碱裂解法基本原理
基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的 差异而达到分离目的。
pH =12.6（碱性）
pH=中性
染色体DNA：氢键断裂，变
性。
NaAc溶液
质粒DNA：大部分氢键断裂，（pH4.8） 但超螺旋共价闭合环状的两 条互补链不会完全分离。 （不完全变性）
30s
弃滤液
絮状沉淀
6. 洗柱 600μl
洗涤液W
12，000rpm
600μl
30s 弃滤液
洗涤液W
12，000rpm
30s
弃滤液
空柱
12，000rpm 2 min
7. 洗脱
取吸附柱至 另一新EP管
50μl 洗脱液
室温静置 12，000rpm
1min
1 min 收集洗脱液备用
二、质粒DNA定量测定
质粒提取、定量和酶切鉴定
pMD18-T
质粒提取、定量和酶切鉴定
质粒DNA的酶切分析操作
在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：
反应物
体积（µl)
2 10× M 酶切缓冲液
2
3 质粒DNA
10
4 Hind III
1
EcoR I
1
1 H2O
6
混合后37 ℃水浴1～2h
质粒提取、定量和酶切鉴定
质粒提取、定量和酶切鉴定
DNA或RNA的纯度判定 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
质粒提取、定量和酶切鉴定
三、质粒DNA的酶切分析
• 质粒 DNA: ～3 kb
载体: pMD18-T 2.7kb 基因: CHD5 1.4 kb
质粒提取、定量和酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳操作 • 琼脂糖凝胶的制备 • 上样：加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀 • 电泳 ：电压100v；30min • 结果观察：凝胶成像仪
质粒提取、定量和酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳上样
-
1234
+
每组上2个样品
1：DNA Marker（ 5 l ） 2：提取的质粒DNA （ 5 l ） 3：质粒DNA酶切产物 （ 10 l ）
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实验仪器
• 微量移液器 • 离心机 • 恒温水浴箱 • 紫外检测仪 • 电泳仪 • 水平电泳槽
质粒提取、定量和酶切鉴定
一、碱裂解法提取质粒DNA
• 独立于细菌染色体 以外，能独立自主 复制的闭合环状 DNA分子
• 基因工程常采用的 载体
质粒提取、定量和酶切鉴定
质粒提取方法：
基本原理
利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性 紫外分光光度计
质粒提取、定量和酶切鉴定
操作步骤
1. 取5l提取的质粒DNA，加入95l蒸馏水 2. 混合均匀 3. 用紫外分光光度计测定A260
质粒提取、定量和酶切鉴定
紫外光吸收法：
DNA或RNA的定量 A260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
质粒DNA：复性，溶于溶液中 染色体DNA：不能复性；形成缠连 的网状结构。
离心
染色体DNA与不稳定的大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来
质粒提取、定量和酶切鉴定
试剂盒的组成：
溶液S1（细菌悬浮液） 裂解液S2 中和液S3 洗涤液W 洗脱液 RNase A(100mg/ml) DNA吸附柱
限制性内切酶
• 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的 特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切 割双链DNA。
• 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为 4～6个核苷酸的反向重复序列。
GGATCC CCTAGG
质粒提取、定量和酶切鉴定
EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： • EcoRⅠ：G↓AATTC • HindⅢ：A↓AGCTT