实验四_变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳

实验四变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）

一、实验原理

变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变(20, 42, 52, 53)。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究 (50)。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE） (49)。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一 (49, 51)。

1．原理

双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。

一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) (20, 42)。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成（图1）。当温度逐渐升高（或是变性剂浓度逐渐增加）达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。（图1显示的是一个234bp长的DNA片段的解链区域，横坐标是该DNA片段的序列，依次从第一个碱基到第234个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA片段共有3个解链区域。MD1是解链温度最低的一个解链区域，MD3是温度最高的一个解链区域。）

MD1

MD2MD3图1：DNA 片段解链区域示意图

不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。当它们进行DGGE/TGGE 时，一开始温度（或变性剂浓度）比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦DNA 片段迁移到一特定位置，其温度（或变性剂浓度）刚好能使双链DNA 片段最低的解链区域解链时，双链DNA 片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，同样长度但序列不同的DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。

然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链DNA 分子，此时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50个碱基对）可以解决这个问题。含有GC 夹子的DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每

个碱基处的序列差异都能被区分开 (52, 53)。

当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR （polymerase chain reaction ）扩增技术，用PCR 扩增的16S rRNA 产物来反映微生物群落结构组成。通常根据16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的5’-端含有一段GC 夹子，用来扩增微生物群落基因组总DNA ，扩增产物用于DGGE/TGGE 分析。

DGGE/TGGE 有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。前者是指变性剂梯度或温度梯度的方向和电泳方向垂直；后者是指两个方向是平行的。在分析微生物群落的PCR 扩增产物时，一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围或温度范围。垂直电泳时，胶从左到

右是变性剂梯度或温度梯度（图2）。在胶的左边，变性剂浓度或温度低，DNA片段是双链形式，因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的另一边，由于变性剂浓度或温度高，DNA一进入胶立刻就发生部分解链，因此迁移很慢。在胶的中间，DNA片段有不同程度的解链。在变性剂浓度或温度临界于DNA片段最低的解链区域时，DNA的迁移速率有急剧的变化。因此，DNA片段在垂直胶中染色后呈S形的曲线，如图2所示。根据垂直电泳确定的范围，再用水平电泳来对比分析不同的样品，如图3所示。

图

2：垂直胶（太原焦化厂活性污泥

16S rDNA V3区PCR扩增产物）

图3：水平胶（太原焦化厂两个嚗气池活性污泥16S rDNA V3区扩增产物）

在用水平电泳分析样品之前，先要优化确定电泳所需时间。一般采用时间间歇（time travel）的方法，即每隔一定时间加一次样品，从而使样品的电泳时间有一个梯度，如图4所示。根据这个结果，确定最佳的电泳时间。

图4

：时间间歇(time travel) （太原焦化厂

活性污泥16S rDNA V3区PCR扩增产物）

通过各种染色方法可以看到DGGE/TGGE胶中的DNA条带。最常用的几种染色方法是溴化乙啶（ethidium bromide, EB） (51)，SYBR Green I (51), SYBR Gold (68)和银染法 (66)。EB法染色的灵敏度最低。SYBR Green I和SYBR Gold相比EB，能更好地消除染色背景，因此它们的检测灵敏度比EB法高很多。EB和SYBR染色时，双链DNA能很好地显色，单链DNA基本上不能显色。银染法的灵敏度最高，它不但能染双链DNA，也能染单链DNA，但它的缺点是不能用于随后的杂交分析 (51)。