原 位 杂 交 原理

优
点
（1）能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它
成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA 或RNA研究更为方便；
（2）由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶 序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反 映出组织细胞的相互关系及功能状态。
（1）载玻片的处理：清洁无核酸酶污染（洗衣粉泡过夜，水冲，酸泡48小时，双蒸水冲2-3次，干燥，160℃烤2-4小时或15磅高压灭菌20分 钟），用新鲜配制的 1mg/ml 多聚赖氨酸（ Mr300000 以上）作为组织 细胞粘附剂。也可用明胶液。 （2）湿盒： （3）探针的标记：放射性标记与非放射性标记；探针长度50-300 bp， 小分子探针穿透力强，大分子探针可在组织细胞中形成网络而增加杂 交信号，同时也使本底增高。 （ 4 ）杂交条件：杂交的特异性依赖于探针的结构、杂交温度（高温严 谨）、pH及杂交液中甲酰胺（高浓度）和盐离子的浓度（低盐）；硫 酸葡聚糖提高探针相对浓度

方
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
百度文库
法
取材 固定 脱水和包埋（按常规组织切片技术操作） 切片 杂交 冲洗与显色 终止显色与复染 封片 观察与拍照
固

定
现场取濒死斑节对虾，于第2、3腹节间和头胸部注射Davidson’s AFA固定液 全身固定，切取头胸部，从额剑将头胸部分成 2部分，再置Davidson’s AFA
分
类


根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交； 根据其所用探针及所要检测核酸的不同可分为 DNA---DNA杂交 RNA---DNA杂交 RNA---RNA杂交
试
剂





TNE: 50mmol/L Tris-HCl,pH7.4,10mmol/L NaCl, 1mmol/L EDTA 20×SSC: 3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0(用10mol/L NaOH调) 2×SSC: 17.53g NaCl，8.82g柠檬酸钠，pH7.0(用10mol/L NaOH调)，定 容至1L 杂交液: 4×SSC,50%甲酰胺，1×Denhardt’s，5%硫酸葡聚糖，0.5mg/ml 鲑精DNA BufferI: 0.1mol/L Tris-HCl,pH7.5,0.15mol/L NaCl BufferII: 0.5% Blocking agent,BufferI BufferIII: 0.1mol/L Tris-HCl,pH9.5,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L MgCl2 BufferIV: 10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA 显色液：4.5μl NBT + 3.5μl X-phosphate + 1ml BufferIII
原 位 杂 交 原理
原位杂交技术是分子生物学和组织化学成功结合的产物。 是以特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片 中核酸进行杂交并对其实行原位检测的方法（in situ hybridization）。 基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针， 在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。

Tm—融解温度：变性的DNA达到总量1/2时的温度。 Tm受溶液中的离子的种类、离子强度、DNA中碱基组成的均一性 以及G-C碱基对含量等因素的影响
PCR教学

复性（退火）
DNA与 DNA; DNA 与RNA; RNA 与RNA 。
6 min 5min 过夜
冲洗 与 显色
2×SSC 37℃ 1×SSC 37℃ 0.5×SSC 37℃ 0.1×SSC 37℃ 1×BufferI 室温 BufferII 200μl/片 室温 Ap(用BufferII 稀释5000倍）100μl/片 37℃ BffeurI 室温 BufferIII 室温 NBT/BCIP(200μl溶于10ml BufferIII中)， 200μl/片，避光勿动 室温
交
I
60℃ 二甲苯 1/2无水乙醇 + 1/2二甲苯 无水乙醇 95%乙醇 80%乙醇 70%乙醇 50%乙醇 dH2O
45min 10min×2 5min 2～3min×2 2～3min×2 2～3min 2～3min 可停留 2～3min 可停留 2～3min
杂
③ 消化：
交
II
5min 10 min 5min 5min
1×TNE PrK 10μg/ml 200μl/片，37℃， (10mg/ml母液用1×TNE稀释1000倍) ④ 后固定： 0.4%甲醛 ⑤ 杂交： 2×SSC 探针先于100℃变性5～10 min，立即置冰上5min，甩。 含10～25ng/100μl探针的杂交液100μl/片， 并用盖玻片和矿物油封片， 95℃， 立即置冰上 42℃杂交
探 针

原位杂交探针的非放射性标记物
DIG标记与检测试剂盒（B.M公司）： Digoxigenin，类固醇半抗原，可与DNA、RNA及寡核苷酸杂交， 随后用显色或发光检测。DIG与dUTP通过碱不稳定酯键相连为DIG11-dUTP，因此可用NaOH洗掉探针，以进行第二个探针的杂交。
探针标记

探针 探针是原位杂交中用于组织细胞内特定的DNA或ｍＲＮＡ序列定位的关 键试剂。
PCR教学
DNA双螺旋学说---1953年，Watson和Crick提出。 两条链上的碱基必须是腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）;鸟嘌呤(G)与胞 嘧啶（C）配对。G与C之间以3个氢键，A与T之间以2个氢键连接。 加热至近100°C、或PH〉10、PH<3、以及某些化学试剂，如乙酸、 尿素和酰胺等，都可引起DNA变性-------即解链。
种类：双链cDNA ,单链cDNA，合成寡合苷酸、 单链cRNA及 PCR产物。 长度：50---300个碱基（bp）。 探针制备 探针标记 地高辛精是一种仅存于洋地黄类植物的花和叶子中的类固醇半抗原 。 * 探针检测 用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体及免疫组织化学技术检测
注 意 事 项：
70%乙醇 80%乙醇 95%乙醇 无水乙醇 1/2无水乙醇 + 1/2二甲苯 二甲苯 1/2二甲苯 + 1/2石蜡 石蜡I 石蜡II 石蜡III 石蜡包埋 1h×2 1h×2 1h×2 45min×2 20 min 5 min×2 30 min 45min～1h 45min～1h 45min～1h 可停留 可停留
固定液中固定24h ，转入70%乙醇中保存。
组织块(V) ：固定液(V)= 1 ：30 Davidson’s AFA固定液配方（1升）： 95％乙醇 330 ml 福尔马林（37％～39％甲醛水溶液） 220 ml 冰醋酸 115 ml H2O 335 ml 混匀后封口，室温放置。

脱水和包埋（按常规组织切片技术操作）
60 ℃烘箱 60 ℃烘箱 60 ℃烘箱 60 ℃烘箱
切
片
① 载玻片和盖玻片的准备： 3% HCl + 95%乙醇泡30min以上，擦干备用。 硅化载玻片： 2% APES于丙酮中 2min 丙酮 1min dH2O 1min 37℃ 烘干备用 ②切4μm厚，42℃展片。
杂
① 烘片： ② 脱蜡与水化：
5min×2 5min×2 5min×2 5min×2 5min 5min 30～45min 5min×2 5min 2 h～过夜
终止显色、复染与封片
BufferIV停止显色
室温
15min
dH2O
中性红或Bismark棕Y复染 dH2O洗 封片、观察及拍照
2～3min
1min 3次
参考文献
1、 Bruce,L.D.,et al.1993.Application of gene probes to detect a penaeid shrimp baculovirus in fixed tissue using in situ hybridization.Disease of Aquatic Organisms 17:215-221. 2、 Mari,J.,et al.1993.Partial cloning of the genome of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,an unusual parvovirus pathogenic for penaeid shrimps;diagnosis of the disease using a specific probe.J.General Virology 74:2637-2643. 3 、 Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual.Boehringer Mannheim Corporation, BiochemicalProducts, 9115 Hague Road,P.O.Box50414,Indianapolis, IN 46250,USA.pp.1-75. 4、 Poulos,B.T.,et al.1994.Use of non-radioactively labeled DNA probes for the detection of a baculovirus from Penaeus monodon by in situ hybridization on fixed tissue.J.Virological Methods 49:187-194.
应
用
于60年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该 技术已广泛地应用于医学分子生物学的研究中，对于研究细胞的生物学功能、 基因表达的规律、肿瘤发生机制及病原微生物的检测，有广泛的应用前景。 如： （1）用标记的探针与分裂中期染色体DNA杂交以研究染色质中特定核酸序 列在染色体中的精确定位； （2）与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平； （3）用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以确 定有无该病原体的感染等。