第十二章荧光分析法

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有机化合物分子结构与荧光的关系
（芳香环、稠环或杂环） 共轭系统↑→ f ↑→ex、 em↑
长共轭结构
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稠芳环分子的几何排列对荧光的影响
含有长共轭双键的脂肪烃
CH2OCOCH 3 VA
ex=327nm， em=510nm
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荧光定量分析方法
校正曲线法(F~C)
荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别
0 UV-vis 100%
荧光分析法
T=0，A=∞ T=100%，A=0 关闭光闸，光不 空白溶液，光全 透过，全吸收 透过，不吸收 F=0 F=100% 对照品溶液Cmax 空白溶液， 不发射荧光 F=50%(Cmid)
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散射光
散射光(scattering light)：由于光子与物质分子相互 碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。
种类 瑞利光(Reyleigh scattering light)：弹性碰撞， 不发生能量交换，仅改变光子运动方向，波长 及频率不变。 拉曼光(Raman scattering light)：非弹性碰撞， 发生能量交换，光子的运动方向和波长、频率 均发生改变。 较长拉曼光干扰荧光测定。
I
I A lg （吸收） I0
垂直于入射光
F
F∝C
荧光分析法
(S=10-9~10-12g/ml)
（发射）
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优点：灵敏度高
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荧光分析法的基本原理
分子荧光的产生原理 荧光物质分子的光谱特征 荧光强度及其影响因素
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单重态与三重态
（能量损失）
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荧光光谱与激发光谱呈镜像关系
S0→S2*激发光谱 S0→S1*激发光谱

荧光光谱
蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）
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荧光光谱的特征（续前）
蒽的能级跃迁 激发光谱：S0(V=0)→S1*(V=1,2,3,4) 荧光光谱：S1*(V=0)→S0(V=1,2,3,4)
-R、-SO3H、-NH3+→对f 无影响
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影响荧光强度的外界因素 温度 T↓→F↑
溶剂 极性↑→f↑→F↑→↑
粘度↓→分子间碰撞几率↑→F↓ 含重原子(CBr4、CH3CH2I)→F↓ 形成氢键→S1*(V=0) 分子↓→F↓ pH值 弱酸、弱碱 NH3+ OH H+ NH2 OHH+
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激发态分子返回基态的途径（续前）
外部能量转换（外转换）碰撞转移能量
体系间跨越
来自百度文库S1*(V=0)
热平衡过程
S0(V=n)
非辐射 S1*(V=0) 非辐射 T1*(V=n)
磷光发射
S1*(V=0)
内转换
T1*(V=n)
体系间跨越
辐射
Sn*(V=n) T1*(V=n)
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振动驰豫
S1*(V=0)
F0 / e F0 e
K f
t=f→Ft=(1/e)F0
1/ e e
K f
K f 1 K 1 / f
Ft/F0-t作图→直线斜率=1/f → f =1/斜率
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荧光效率(fluorescence efficiency) 荧光量子产率(fluorescence quantum yield) 发射荧光的光子数 f 吸收激发光的光子数
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荧光强度F与浓度C的关系
荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透 射光干扰。 F=K(I0–I) (I=I010-ECl) =K(I0-I010-ECl) =KI0(1-10-ECl) 激发光源 垂直方向 =KI0(1-e-2.3ECl) 太劳极数展开式： 溶液的荧光测定 ex=1+x/1！+x2/2！+x3/3！+……
分析对象
激发光波长范围
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•原子荧光分析 •分子荧光分析 •紫外-可见荧光分析 •红外荧光分析 •X射线荧光分析
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荧光分析法概述（续前）
荧光分析法与紫外-可见分光光度法的主要区别
平行于入射光 A∝C (S=10-6~10-7g/ml)
UV-vis
紫外光
I0
样品溶液
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分子的刚性和共平面性 共轭系统的刚性和共平面性↑→f↑
-
联苯f=0.2
O
O
芴f=1.0
-
O
O
O
COO酚酞
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COO荧光素钠
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金属离子络合增加分子刚性和共平面性
OH N N O Mg1/2
8-羟基喹啉
SO3Na CH3 CH3
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
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荧光光谱
激发光谱
硫酸奎宁的激发光谱及荧光光谱
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e 2.3 ECl
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2.3ECl (2.3ECl) 2 (2.3ECl) 3 1 1! 2! 3!
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F与C的关系推导（续前）
2.3ECl (2.3ECl) 2 (2.3ECl)3 F K I 0{1 [1 ]} 1! 2! 3! (2.3ECl) 2 (2.3ECl) 3 K I 0 [2.3ECl ] 2! 3!
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荧光光谱的特征
斯托克斯位移(Stokes shift)
荧光发射波长总是大于激发光波长 Sn*(V=n)
内转换
振动驰豫
S1*(V=0)
辐射
S0(V=n)
荧光光谱的形状与激发波长无关
激发：S0(V=0)→Sn*(V=n) 荧光：S1*(V=0)→S0(V=n)
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8-羟基喹啉镁
位阻效应和立体效应→ f↓
N
位阻效应
H3C NaO3S N CH3
1-二甲氨基萘-7-磺酸盐 f=0.75
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1-二甲氨基萘-8-磺酸盐 f=0.03
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取代基 供电子基： –NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN →f ↑，F↑
吸电子基： -NO2、-COOH、-NHCOCH3、 -C=O、-NO、-SH、-X → f ↓，F↓，甚至荧光熄灭
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荧光寿命和荧光效率
——荧光物质的两个重要发光参数 荧光寿命(fluorescence lift time,f)：当激发光停止
照射时，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强 度的1/e所需的时间。 指数衰减定律： Ft = F0e-Kt (K：衰减常数)
荧光定量分析的依据
ECl≤0.05
F=2.3KI0ECl =KC
荧光分析法仅适用于稀溶液的测定 满足定量分析条件： ECl≤0.05→F∝C 降低荧光自熄灭（内部猝灭）作用 灵敏度高（放大信号）
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荧光分析法与UV-vis灵敏度差异
荧光分析法定量依据：F∝I0及C 检测信号：F=2.3KI0ECl C↓→F↓ →放大信号（检测灵敏度↑ ） → I0↑→F↑→荧光分析灵敏度高 (S=10-9~10-12g/ml) 紫外-可见分光光度法定量依据：A∝C 检测信号：A=-lg(I/I0)=ECl C↓→I0/I≈1→A≈0 →放大信号→I0↑，I↑ →I/I0不变→UV-vis灵敏度受限，不如荧光分析 (S=10-6~10-7g/ml)
荧光分析法
• 荧光分析的基本原理 • 荧光定量分析方法 • 荧光分析仪器与技术
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荧光分析法概述
光致发光：吸收某种波长的光后发射出 比吸收波长更长的光的现象。 (荧光和磷光) 荧光分析法 荧光光谱→定性分析 (fluorormetry) 荧光强度→定量分析
荧光分析的分类
激发单重态(S) 激发三重态(T)
基态(S0)
单重态(siglet state,S)： 总自旋量子数s=1/2+(-1/2)=0;多重性M=2s+1=1 三重态(triplet state,T)： s=1/2+1/2=1； M=2s+1=3
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激发态分子返回基态的途径
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激发320nm 荧光光谱
激发350nm 荧光448nm
拉曼光谱
瑞利光320nm
瑞利光350nm
拉曼光360nm
拉曼光400nm
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
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荧光定量分析
荧光定量分析的依据——F与C的关系 荧光定量分析方法 荧光分析法与UV-vis定量分析的区别
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NH-
pH<2
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pH7~12 兰色荧光
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pH>13
荧光熄灭剂 荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子 与溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强 度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。 荧光熄灭剂(quenching medium)：引起荧光熄 灭的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子 以及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化 合物均为常见的荧光熄灭剂。
振动弛豫(vibrational relexation) 内部能量转换(internal conversion)
荧光(fluorescence)发射
外部能量转换(external conversion)
体系间跨越(intersystem crossing)
磷光发射
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荧光定量分析方法（续前）
空白调零降低测定的灵敏度：仪器调零→ F0→Fs和Fx→扣除空白(Fs-F0、Fx-F0)计算。 比例法 适用：校正曲线过原点 Fs F0 Cs Fx F0 Cx Cs Fx F0 C x Fs F0 多组分混合物测定 原理：荧光强度的加和性 方法：解联立方程
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第二电子 激发单重 态(S2*)
内转换
振动弛豫
体系间跨越
激发态→基态途径（图） S1*(V=0)
第一电子 激发三重 态(T1*)
第一电子 激发单重 态(S1*)
吸收
外转换 磷光
荧光
基态(S0)
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激发态分子返回基态的途径（续前）
非辐射
振动弛豫 S1*(V=n)
物 质
f
0.92 0.65 0.30
溶 剂
水 水 乙醇
荧光素钠 荧光素 蒽
菲
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1.00
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乙醇
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物质分子能发射荧光的两个必要条件
有强的紫外-可见吸收
有一定的荧光效率
n→* 弱吸收，体系间跨越几率大，荧光较 弱，意义不大。 →* 共轭双键，K带强吸收，荧光效率高， 荧光强度强。
T1*(V=0)
振动弛豫
（10-4~10s）
S0 (V=n)
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荧光和磷光的主要区别
发光机制 荧光 单重态→单重态 磷光 三重态→单重态
实验现象
激发光停止照射→荧光立 即消失
激发光停止照射→磷光仍 将延续一段时间
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激发光谱与发射（荧光）光谱
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引起荧光熄灭的原因
碰撞→损失能量 作用→不发光物质 重原子Br/I→体系间跨越→三重态 溶解O2→荧光物质氧化/ O2顺磁性→体系间跨越→三重态 荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分子间碰 撞几率而产生的荧光熄灭现象。 (浓度限量1g~1mg/ml) 荧光熄灭法(fluorescence quenching method)：利用荧光物质荧 光强度的减弱与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂 含量的方法。
~10-12s
非辐射 E很小
S1*(V=0)
内部能量转换（内转换） S2*(V=0) 荧光发射 内转换 Sn*(V=n)
S1*(V=n)
辐射
振动驰豫
S1*(V=0)
S0(V=n)
荧光：物质分子接受光能激发后，从第一电子 激发态最低振动能级返回基态时发射出的光。
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