生物化学实验

生物化学实验讲义

化学工程与技术学院

基础部

实验一酪蛋白的制备

一、目的

学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。

二、原理．

牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为 4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。

三、器材

1 、离心机 2、．抽滤装置

3、精密pH试纸或酸度计

4、电炉

5、烧杯

6、温度计．

四、试剂与材料

1、牛奶 2500mL

2、95％乙醇 1200mL

3、无水乙醚 1200mL

4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液 3000mL

5、．乙醇—乙醚混合液2000mL

五、操作

1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预

热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH 试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。

2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)，

弃去上清液。

3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬

浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。

4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。

5、准确称重，计算含量和得率。

含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)

得率：

测得含量

%

100

理论含量

思考题

1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？

实验二 小麦萌发前

后淀粉酶活力的比较

一、目的

1.学习分光光度计的原理和使用方法。

2.学习测定淀粉酶活力的方法。

3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理

种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。

2

（C 6H 10O 5）

n

+nH 2O

nC 12H 22O 11

麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。

OH

COOH

NO 2O 2N

OH

COOH

O 2N

NH 2

3,5 —二硝基水杨酸还原反应

（棕色）

休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。

本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。

三、器材

1.25mL刻度试管

2. 吸管

3.离心管

4.乳钵

5.分光光度计

6.恒温水浴

7.离心机

四、试剂和材料

1、小麦种子

2、o.1％标准麦芽糖溶液

精确称量100mg麦芽糖，用少量水溶解后，移入100mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度。

3.pH6.9，0.02mol/L磷酸缓冲液

0.2mol/L磷酸二氢钾67.5mL与0.2mol/L磷酸氢二钾82.5混合，稀释10倍。

4、1％淀粉溶液

1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸缓冲

液中，其中含有0.0067mol/L氯化钠。

5、1％3，5—二硝基水杨酸试剂

将1.00g3，5—二硝基水扬酸溶于20ml 2M L1NaOH 溶液和50ml水中，加入30g酒石酸钾钠定容至100ml。

6、1％氯化钠溶液

五、实验操作

1、种子发芽小麦种子浸泡2.5小时后，放入25℃恒温箱内或在、室温下发芽。

2、酶液提取取发芽第3或第4天的幼苗15株，放入乳钵内，加入1%氯化钠溶液10mL，用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。然后将提取液离心（1500r/min）6—7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将发芽第3或第4天的幼苗稀释10倍。

取干燥种子15粒作对照（提取步骤同上）。

3、酶活力测定

（1）取25mL刻度试管4支，编号。按下表要求加入各试剂（各试剂须在25℃预热10分钟）

将各管混匀，放在25℃水浴中，保温3分钟后，立即向各管加入1％3，5—二硝基水杨酸溶液2mL。（2）取出各试管，放入沸水浴加热5分钟。冷却至室温，加水稀释至25mL。并混匀。在A500nm处测定各管的吸光度。填入表中

4、计算

根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，

标准

标准酶酶

A C A C ⨯=

本实验规定：25℃时3min 内水解淀粉释放1mg 麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（u ）。酶活力计算公式为：酶酶酶酶活力n V C ⨯⨯=

式中：C 酶 酶液麦芽糖的浓度，V 酶 提取酶液的总体积，n 酶酶液稀释倍数。

思考题

1、

为什么此酶提纯整个过程在0—5条件下进行？

而测酶的活力时要在25预保温？反应后又放入沸水浴中？

2、 实验结果说明什么？

实验三 纸层析法分离鉴定氨基酸

一、目的

通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用R f 值(比移)来表示的：

…

R f

==

原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距

在一定的条件下某种物质的只R 值是常数。R f 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、

层析点

原点