分子生物学基础试验

质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传 因子，大小在1－120kb之间，具有双链闭合 环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线 菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录 能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数， 可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在 细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它 离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许 多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
微量移液器的构造
微量移液器的操作
分离质粒DNA的三个基本步骤:

培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS） 可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理 后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时 易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、 洗涤，可得到质粒DNA。


质粒DNA 的相对分子量一般在 106 － 107范围内，如质粒 pBR322的相对分子质量为 2.8×106，质粒pUC19的相对 分子质量为1.7×106。 在 细 胞 内 ， 共 价 闭 环 DNA （ covalently closed circular DNA ，简称 cccDNA ）常以超螺旋形式存在。 如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就 能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环 DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时， 同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA 的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳 凝胶中呈现3条区带。
质粒在细胞内复制的两种类型


严密控制型（stringent control）：质粒只在细胞周期的 一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个 细胞内只含有1个或几个质粒分子。 松弛控制型（relaxed control）：质粒在整个细胞周期中 随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。
分子生物学基础实验
指导老师：肖靓
分子生物学基础实验
分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学 以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为 提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，分子 生物学实验室主要开设常用而基本的分子生物学实 验技术。它的内容包括质粒 DNA的制备；DNA的重 组；PCR基因扩增等等。
通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如 ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控 制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型 ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝， 此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯 化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。
作为基因工程的载体必须具备下列条件

是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源 基因复制繁殖。 载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使 外源基因在受体细胞中大量扩增。 载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切 割位点，便于外源基因的插入。 载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因 （Tcr），抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已 进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他 细胞中分离筛选出来。 细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的 载体之一。
高压蒸汽灭菌锅
超净工作台
பைடு நூலகம்
台式高速离心机
恒温摇床
恒温培养箱
试剂
1.溶液Ⅰ（ pH8.0G.E.T缓冲液）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl， 10mmol/L EDTA。灭菌后存放。临用前加溶菌酶4mg/mL。 2.溶液Ⅱ： 0.2mol/L NaOH (内含1％ SDS)，现配现用。 3.溶液Ⅲ（ pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双 蒸馏水28.5mL。 4.酚/氯仿液(V/v＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使 其体积比为24：1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/L TrisHCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆 盖等体积的0.01 mol/L Tris-HCl (pH7.6)，4℃保存。 5.pH8.0 TE 缓 冲 液 ： 10mmol/LTris-HCl 、 1mmol/L EDTA ， 其中含 RNA 酶 20μ g/mL。 6.无水乙醇 7.70％乙醇 8. LB培养基
实验要求



上课时间与纪律：严格遵守老师的安排。 实验室内禁止饮食、勿高声谈话、随意 走动。 课前预习、课中认真操作、课后的实验 报告。 妥善保管好每组的实验器具。 实验操作要求人人动手。 值日制度：每天五位同学。
一、 质粒DNA小量制备的实验原理

要把一个有用的外源基因通过基因工程 手段，送进细胞中去进行繁殖和表达， 需要运载工具，携带外源基因进入受体 细胞的这种工具就叫载体（ vector ）。 载体的设计和应用是DNA体外重组的重要 条件。
二、实验目的与内容

目的：学会使用碱裂解法提取质粒DNA。 内容：细菌培养及菌体的收获、碱裂 解法提取质粒DNA。
三、实验材料和试剂

材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。 仪器： 台式高速离心机、台式小型振荡器、EP 管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～ lmL)、吸头。
LB培养基的配制

每升含有胰蛋白胨10g,酵母提取物5g， NaCl10g,琼脂糖或琼脂（固体培养基时 用）15g,用NaOH调pH至7.5。
微量移液器（pipetman）的使用

微量移液器是连续可调的，计量和转移 液体的专用仪器，其装有直接读数容量 计，读数由三位拨号数字组成，在移液 容量范围内能连续调节，从上（最大数） 到下（最小数）读取。