核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
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凯基核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
Cat Number：For Research Use Only
Store at -20℃ for one year
Expire date：
一、 试剂盒说明
本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞浆蛋白，提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性，并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。
二、 试剂盒组份
组份 KGP150 （50 test） KGP1100 （100 test） 储存温度
Buffer A 25 mL 25 mL ×2 4℃
Buffer B 1.5 mL 3．0 mL 4℃
Buffer C 12.5 mL 25 mL 4℃
DTT 50μL 100μL -20℃
蛋白酶抑制剂 250μL 500μL -20℃
PMSF（100mM）400μL 800μL -20℃
三、操作步骤
Ⅰ 实体组织蛋白的提取
1、组织样本，将组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS均浆后，静置5 min ，弃沉淀，小心吸取上清转移至另一
离心管中；
2、上清4℃离心500×g，3 min，弃上清，估计细胞压积PCV（离心后的紧实细胞体积）；
3、每20μL细胞压积中，加入200μL预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，
5μL蛋白酶抑制剂】，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上10～15min；
4、加入11μL冷Buffer B，最大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上1min；
5、再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后， 4℃离心，16000×g,5min；
6、尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞浆蛋白；
7、在离心沉淀物（细胞核）中加入100μL预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，
5μL蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds；
8、4℃离心，16000×g,,10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白；
9、上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量（Braford法或BCA法），分装并保存于-80℃，避免反复冻融。
Ⅱ 培养细胞蛋白提取
1、取培养细胞5×106～1×107个/mL，4℃离心，500×g,3 min收集细胞，弃去培养液，用预冷的PBS洗涤两遍；
2、用移液枪尽可能取去上清，勿留残液，估计细胞压积PCV（离心后的紧实细胞体积）；
3、每20μL细胞压积中，加入200μL预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，
5μL蛋白酶抑制剂】，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上10～15min；
4、加入11μL冷Buffer B，最大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上1min；
5、再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后， 4℃离心，16000×g,5min；
6、尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞浆蛋白；
7、在离心沉淀物（细胞核）中加入100μL预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1μL DTT，5μL 100mM PMSF，
5μL蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds；
8、4℃离心，16000×g,,10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白；
9、上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量（Braford法或BCA法），分装并保存于-80℃，避免反复冻融。
四、 注意事项
1、 所有的试剂及器具均需预冷后使用；
2、 细胞的数量不应少于0.5×107个/mL；，
3、 以上各缓冲液的使用量是以20μL细胞压积为例，如细胞压积不同，请参考下表加入各缓冲液。
细胞压积PCV Buffer A Buffer B Buffer C
10μL 100μL 5.5μL 50μL
20μL 200μL 11μL 100μL
50μL 500μL 27.5μL 250μL
100μL 1mL 55μL 500μL
4、一般常规提取的蛋白样品，进行后续试验不需要透析，但如果需要较大量的提取蛋白或后续试验结果不理想，
则需要将提取的蛋白样品进行透析脱盐，建议使用凯基透析Buffer (Cat: KGB—P001)透析后进行后续分析。
五、 凯基相关产品（详见凯基网站）
1、蛋白提取
核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
全蛋白提取试剂盒
膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白提取试剂盒
磷酸化蛋白提取试剂盒（简易型）
活性蛋白提取试剂盒
红细胞裂解液
细菌蛋白提取试剂盒
酵母蛋白提取试剂盒
植物蛋白提取试剂盒
蛋白裂解液系列
2、蛋白定量
BCA法蛋白定量检测试剂盒
Bradford法蛋白定量检测试剂盒
Lowry法蛋白定量检测试剂盒
3、蛋白染色
蛋白质银染检测试剂盒
蛋白质考马斯亮蓝染色检测试剂盒
考马斯亮蓝蛋白快速染液
4、蛋白分子量Marker
蛋白分子量Marker（14KD-116KD）
蛋白分子量Marker（10KD-200KD）
预染蛋白分子量Marker（20KD-118KD）
预染彩色蛋白分子量Marker（11KD-250KD）