高效液相色谱HPLC常见问题分析
高效液相色谱仪使用中常见问题及对策
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高效液相色谱仪使用中常见问题及对策高效液相色谱(HPLC)作为一种分离技术和方法,目前已经发展到一个全新的阶段。
高精度的输液泵,应用广泛的色谱分离柱,低噪音、高灵敏度的各种检测器和功能强大的数据处理软件系统的出现,都推动了液相色谱技术的迅猛发展。
液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐,广泛地应用于医药卫生、环境监测、食品检测等领域。
作者本人从事液相色谱分析工作二十多年,应用HPLC技术在血药浓度、生物胺、核苷酸、蛋白质浓度测定等实际工作中,积累了许多的方法和经验,在这里与大家交流,希望能对同行们有所帮助和借鉴,共同促进液相色谱分析技术的发展。
1高效液相色谱仪的基本工作原理高效液相色谱仪如图1所示,是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。
高压泵从溶液贮器中抽走流动相,流经整个仪器系统,形成密闭的液体流路。
样品通过进样系统注入色谱分离柱,在柱内进行分离。
柱流出液进入检测器,使已被分离的组分逐一被检测器收集,并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰,通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算[1]。
液相色谱仪是依靠色谱柱进行分离的。
研究证明:物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相(液相和固相)中分配“平衡”的过程。
液相色谱是以具有吸附性质的硅胶颗粒为固定相,各种洗脱液为流动相。
当液体样品在载体流动相的推动下,在液-固两相间作相对运动时,由于各组分在两相中的分配系数(K)不同,则使各自的移动速度不同,即产生差速迁移。
各组分在两相间经过多次分配,从而达到使混合物分离的目的。
上式反映了物质在两相中进行吸附、解吸、再吸附、再解吸…过程中,由于在两相中浓度的不同,而存在分配系数上的差异。
既然分配系数及其差异是引起组分在液相色谱柱分离的根本原因,那么,必然地也会同色谱理论中可测宏观量之间存在着某种定量关系,事实上,色谱理论中通常用容量因子k’的概念来反映物质在两相中的分配关系:k’值可以非常方便地表达组分在两相的分配,又很容易从色谱实验数据中直接测得,是色谱理论中重要的基本参数之一[2]。
hplc压力问题及排查方法
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hplc压力问题及排查方法
HPLC(高效液相色谱)的压力问题可能包括压力过高或过低。
下面是一些常见的排查方法:
1. 检查柱连接:确保柱连接紧密,并且没有漏气或松动的地方。
可以用手轻轻转动连接处,看是否有松动。
需要重新连接的话,确保连接处干净无异物。
2. 检查管道:检查管道是否有任何堵塞或压力泄漏的情况。
可以检查压力节流阀、减压阀和调节阀等部件。
3. 检查流量设置:检查流量设置是否正确。
如果设置过高,则可能会导致压力过高。
参考仪器的操作手册,按照所需的分析条件进行设置。
4. 检查溶剂:确保使用的溶剂无杂质或气泡。
杂质或气泡可能会导致压力过高。
可以尝试更换新鲜的溶剂,或者通过过滤器除去杂质。
5. 检查柱压力:检查柱的压力是否正常。
柱的堵塞、损坏或老化可能导致压力过高。
如果怀疑柱的问题,可以尝试更换新的柱试试。
6. 检查泵:检查泵的泵头、活塞和密封环是否良好。
泵的密封环磨损或泵头松动可能导致压力问题。
7. 检查压力传感器:检查压力传感器是否正常工作。
如果压力传感器损坏或失灵,可能导致压力测量不准确。
如果以上排查方法仍然无法解决问题,建议联系仪器厂家或技术支持,寻求进一步的帮助和建议。
高效液相色谱基线的各种问题讲解
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高效液相色谱基线的各种问题L、基线漂移原因解决方法1、柱温波动。
(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。
通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。
)1、控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器图2、流动相不均匀。
(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。
)2、使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。
流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。
如有需要,可以用1N的硝酸。
(不要用盐酸)4、检测器出口阻塞。
(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)4、取出阻塞物或更换管子。
参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化5、更改配比或流速。
为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢,特别是流动相发生变化时6、用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成7、检查流动相的组成。
使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂8、样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。
8、使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂,但检测器未调整。
9、重新设定基线。
当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
10、将波长调整至最大吸收波长处M、基线噪音(规则的)原因解决方法1、在流动相、检测器或泵中有空气1、流动相脱气。
冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液图2、见第三部分。
检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。
如有必要,更换泵密封。
3、流动相混合不完全3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂4、温度影响(柱温过高,检测器未加热)4、减少差异或加上热交换器5、在同一条线上有其他电子设备5、断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。
高效液相色谱出现杂峰_解释说明以及概述
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高效液相色谱出现杂峰解释说明以及概述1. 引言1.1 概述在进行高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析的过程中,常常会出现不期望的杂峰。
这些杂峰可能来源于色谱柱、样品制备方法或仪器条件等多个方面的问题。
分析人员需要了解和掌握这些可能导致杂峰产生的原因,并采取相应的方法来鉴定和消除这些杂峰,以确保分析结果准确可靠。
1.2 文章结构本文将从以下几个方面来详细讨论高效液相色谱中出现杂峰的问题。
首先介绍高效液相色谱的原理及其在不同领域中的应用;然后探讨高效液相色谱分析中可能导致杂峰产生的主要原因,包括色谱柱问题、样品制备问题和仪器条件问题;接着介绍鉴定和消除这些杂峰的方法,包括优化色谱条件、改善样品预处理方法以及使用数据处理技术;最后得出结论。
1.3 目的本文旨在帮助读者深入了解高效液相色谱中出现杂峰的原因及其影响,并提供相应的鉴定和消除方法。
通过掌握这些知识,读者可以更好地进行高效液相色谱分析,避免或解决杂峰问题,提高分析准确性和可重复性。
2. 高效液相色谱部分的内容如下:高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)是一种广泛应用于化学、生物化学、制药等领域的分析技术。
它基于样品中组分在固定填料上的差异分配行为,利用流动相的力量将物质分离并进行检测。
2.1 原理介绍高效液相色谱主要由四个基本组件构成:溶剂输送系统、样品进样器、色谱柱和检测器。
其中,溶剂输送系统会将流动相以一定的速率压入进样器,再通过色谱柱,最后到达检测器。
在流动相的作用下,待测样品被引入色谱柱中,并与填料表面发生相互作用。
这些填料通常是多孔吸附材料或者反相材料等。
不同成分因为在填料表面和流动相之间交换速度不同而被分离开来。
2.2 应用领域高效液相色谱广泛应用于各个领域,包括但不限于以下几个方面:- 化学品分析:HPLC可用于对有机化合物、无机物质、蛋白质和核酸等的检测和分析。
hplc基线漂移的原因
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hplc基线漂移的原因HPLC(高效液相色谱法)是一种高效、准确、灵敏的分析技术,在现代化学研究和实验室分析中得到广泛应用。
然而,HPLC分析中存在着一个普遍的问题,即基线漂移。
基线漂移是指在分析过程中,峰的基线在时间轴上呈现出不稳定的偏移现象,从而影响峰的形状和定量分析结果。
在本文中,我们将一步一步回答关于HPLC基线漂移的原因,以帮助读者充分理解并解决这一问题。
第一部分:基本概念和背景知识在开始解答问题之前,我们首先需要了解HPLC的基本概念和背景知识。
高效液相色谱法是一种基于流动相和静相的柱分离技术,通过在固定的填料柱上使样品成分在流动相中相互分离,进而通过检测器检测并定量分析目标成分。
在HPLC中,流动相、柱和检测器都会对峰的形状和峰面积产生影响。
第二部分:基线漂移的表现基线漂移通常表现为峰的基线在时间轴上呈现出上下波动或持续向上或向下漂移的现象。
这种漂移会导致峰的宽度变大、峰面积变小,进而影响到结果的准确性和可重复性。
基线漂移可以是渐进性的,也可以是突然发生的。
在异质性样品分析中,基线漂移可能会导致误判样品成分的发生。
第三部分:基线漂移的可能原因基线漂移的原因是多方面的,下面我们将一一进行解答。
1. 流动相的问题:流动相选用不当、流量波动、pH值的变化等都可能导致基线漂移。
特别是含有离子的流动相会引起静电效应,进而导致基线不稳定。
2. 柱的问题:柱是HPLC分析的核心部分,其质量和性能直接影响到分离和定量分析的结果。
柱的老化、不洁净、毛细管损坏等都可能导致基线漂移。
3. 检测器的问题:检测器是HPLC分析中用于检测和定量目标成分的重要设备。
检测器的灵敏度、稳定性和响应时间等性能会影响峰的形状和基线的稳定性。
4. 样品的问题:样品的性质和组成可能会导致基线漂移。
例如,样品溶解度低、有色物质、杂质等都会影响峰的形状和基线的稳定性。
第四部分:解决基线漂移的方法针对基线漂移的原因,我们可以采取一系列的措施来解决这一问题。
高效液相色谱中异常峰分析
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异常峰分析异常的色谱峰指的是色谱图中的无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况;异常峰是色谱实验工作中最棘手的问题;这些峰严重影响色谱分析的结果;色谱图中不可能有纯正的高斯对称峰 , 轻微的拖尾是正常的 , 这是由分离系统所决定的;在此仅对几种异常峰进行分析;1.峰前或峰后有小峰的分析产生原因大致分为以下几种情形1 样品不纯;可改变不同的流动相和色谱柱 ,对样品进行分离比较 , 选择合适的分离条件;2 分析柱或保护柱柱头塌陷;此情况较常见 ,可更换分析柱或保护柱后对峰形进行比较;柱头塌陷时往往所有的峰都会出现峰分裂 ;对色谱柱再生和清洗可以改善分离效果;3 色谱柱柱容量下降;当长时间使用后 , 有一些强保留组分吸附在柱子中 , 不大的进样量往往就会出现峰分裂;用强洗脱能力的溶剂清洗色谱柱 , 或更换色谱柱可使问题得到改善;4 样品溶剂与流动相不匹配或进样体积过大;当样品溶剂比流动相极性大时 , 有时即使进样体积很小 , 也容易出现峰变形和裂分现象;建议用流动相溶解样品;5 流动相不恰当;此情况较罕见 , 有些样品在特定的色谱条件下可能存在结构的动态平衡 , 而出双峰 , 这种双峰是无法分离完全的 , 改变色谱条件尤其是p H 值会使峰形正常;6 样品分解;不稳定的样品在色谱分离过程中变成其他物质而出现双峰;这时需改变样品处理方法或色谱分离条件;2.负峰分析在色谱分析中有时会出现负峰或倒峰 , 如图 3 中的大峰的左下就有一负峰;出现这种现象可能是由以下几种原因引起的 , 可针对不同情况进行排除 , 进而使问题得到解决;1 流动相吸收本底值过高;此时可适当改变检测波长;2 进样过程中进入空气;进行排气处理 , 直到基线平稳再进样;3 样品组分的吸收低于流动相;可改变流动相或改变检测波长;4 配制样品的溶液与流动相不一样;重新配制样品 , 用与流动相一样的溶剂配制或稀释样品;3.前沿、拖尾峰分析拖尾:1 干扰峰,优化条件分离;2 色谱柱塌陷,更换色谱柱; 3 流动相pH不合适,调节pH值;4 管路没有接好,存在较大的死体积,可以重新接一下;前沿:1 溶剂选择不合适,选择合适的溶剂;2 样品过载,降低进样量; 3 柱温太低,升高柱温;4 色谱柱损坏,更换色谱柱;图谱前沿和拖尾的原因主要是流动相选择不合适,可以相应调整流动相的极性,或者适当加入酸来调整,可以得到较好的改善;一般来讲,酸碱在流动相中对于前沿和拖尾影响较大; 柱前沿是可能因为柱超载,拖尾是可能因为样品被污染,选择合适的流动相,调节好PH能够改善这以情况;前辈们总是会告诉我们,拖尾峰与柱子有关,可能是过载,稀释样品再做,或换新柱做; 有时候托尾峰往往是有机性相近杂质没有分开,此时,可以优化分析方法,或更换柱子试一试;也可能由于柱子使用时间太久柱效下降出现塌陷等原因;再有也会根样品本身性质有关,基团需要流动相中添加能与之结合优化峰形的化学物质,要根据具体情况而定;4.色谱双峰产生的可能及判断和处理液相上有一句经典的话说得好“出两个峰肯定不是一种物质,出一个峰不一定是一种物质”;而色谱双峰指的是明是一种物质,但在色谱图中出现双峰,而表明含二种物质;我将这种情况分为四种原因;1色谱柱如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现出峰越快,双峰的可能性会减少,尤其采用单一纯物质时,可以肯定色谱柱出问题-柱头受损或柱头固定相变脏或流失;如果进样量少,原来色谱柱正常,色谱峰的形状多为一大峰带一小峰,不一定拖尾,这一般应是柱头受堵,将色谱柱反过来接,用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂,将堵在柱头的残留物冲掉,再反过来,一般情况下就行了;当然不反冲,正冲有时也会正常的;如果峰拖尾,双峰强弱相差不大,柱头固定相变脏或流失可能性更大,高频红外碳硫分析仪这是可以将进样那头拧开,将微孔滤片超声,柱头刮去一部分填料,重新填上新填料拧紧,不过这种活,需要一定技术,同时不能老干那种事,否则用不了几次,色谱柱就会应柱效很低而报废;2溶剂极性及进样量许多HPLC分析者对此可能不以为然,一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容,而这确是双峰产生的一个很重要的原因;目前HPLC分析多为反相色谱,流动相多为甲醇、乙腈、水,加各种添加剂以改善分离性能;样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解;最佳的溶解方法是用流动相溶解,但是很多情况是不一致的;当用溶剂极性强度大的试剂,如纯甲醇、纯乙腈,纯乙醇,而分析体系中以水为主,样品进样量大,如定量管为20ul,此条件下完全可以肯定,单一的纯物质出双峰,第二峰比第一峰小每次都不太一样,且拖尾,保留时间会提前相对进样量少而言,将进样量减少一半以上,峰型将变为正常;这是样品的溶剂与流动相极性相差太大,而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的;上面提到进样量造成双峰的一个原因,另一个原因是,进样量不一定大,但绝对量很大,色谱图上的双峰紧靠在一起,基本上齐高,不拖尾如果出峰很快,也可能是色谱柱问题;将样品稀释再进样就可以了,这是由于进样量过大,色谱柱过载造成的;3样品的特性有些样品由于其化学结构的特点,存在互变异构现象,而这种互变异构体无法分开,而是以一个动态平衡存在;在色谱分析时,在一个特定的条件下,一种物质将出现双峰,双峰靠的很近,基本齐高,不拖尾,条件稍一变化,尤其pH,双峰现象将消失,如红霉素等;有的样品紫外的色谱图上看不到双峰,但在LC-MS下,用质谱检测器,其质谱的总离子流图上较明显,例如我分析过的农药啶虫眯吡虫清;4参数记录的参数一般都内定的,不必修改,但GC和HPLC的参数是不完全一致的,例如C -R3A数据记录仪上的一般记录时间间隔GC为2ms,HPLC 为5ms,如果记录间隔时间缩短,一个峰将变为二个峰或更多;5.鬼峰、倒峰、未出峰6.峰裂分裂峰产生原因的确定样品基质复杂或分析多种样品——柱污染或部分阻塞滤片流动相 pH>=7——由于硅胶溶解导致柱塌陷除非使用专门的柱子溶剂比流动相的强度大——可能产生裂峰或宽峰,由样品量决定溶剂化效应7.峰拖尾、峰展宽、峰前伸峰拖尾原因的确定评价柱选择——使用高纯度硅胶柱或不同键合技术柱评价流动相效果——改变流动相pH和添加剂消除次级效应流动相中组份与柱子相互作用减小进样量消除柱外效应冲洗柱子——检查柱子老化/塌陷易记小卡片来了:其它常见峰异常问题汇总Q&A峰问答进行HPLC分析时,怎样才能知道某一个色谱峰是否是单一峰呢特别是分析中药成分的时候标准品加入法、DAD、还有改变流动相的组成是否能说明呢1、多种不同原理的方法比较是首选;2、其次采用DAD检测器进行光谱分析,如果提示不纯,估计有问题;纯度阈值受仪器、流动相等影响,所以只能作为参考;对于分子结构中差异有紫外吸收官能团的,dad检测器一般还是可以准确判断峰纯度的,但对于结构中无紫外吸收的那些差异,DAD检测器就无能为力了,比如某肽链中的氨基酸差异、或者一些对应异构体,dad也是无能为力的;3、如果DAD不行,那么就需要采用质谱鉴别了,优选液质联用,如果是含盐流动相,可以采用收集不同时段的色谱流出物的方式,脱盐,进行质谱检测;4、如果怀疑有异构体,这个就比较头疼了,非对应异构体需要二级主要是对CID的能量有要求,可以打断侧链的质谱才能判断侧链的区别;对应异构体的辨别目前好像只有waters的离子淌度质谱没做过有一定的分辨能力,但也不是万能的;所以峰纯度判定需要结合化合物及可能杂质的结构特点,来合理选择;。
高效液相色谱常见故障及解决方案
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高效液相色谱常见故障及解决方案1.压力过高或过低-压力过高可能是由于柱堵塞或流动阻力增加所致。
解决方案包括更换柱、清洗柱或检查管路是否存在问题。
-压力过低可能是由于泵的磁力搅拌器不工作或进样器封堵所致。
解决方案包括检查泵的磁力搅拌器是否工作正常,清洗进样器。
2.峰形不对称-峰形不对称可能是由于进样量不均匀或柱温度过高所致。
解决方案包括确保进样量均匀和降低柱温度。
3.峰尾或前肩-峰尾可能是由于柱温度过高、流速过快或流动相pH值不合适所致。
解决方案包括降低柱温度、减慢流速或调整pH值。
-前肩可能是由于流动相中存在杂质或柱堵塞所致。
解决方案包括更换流动相或清洗柱。
4.杂峰或基线噪声-杂峰可能是由于样品纯度不高、固定相老化或试剂污染所致。
解决方案包括提高样品纯度、更换固定相或检查试剂是否污染。
-基线噪声可能是由于进样器密封不良、流动相气泡或电噪声所致。
解决方案包括检查进样器密封情况、减少流动相中的气泡或检查电子设备是否存在干扰。
5.柱寿命短-柱寿命短可能是由于样品预处理不彻底、柱收尾不当或流动相pH值不合适所致。
解决方案包括增加样品预处理步骤、正确收尾柱或选择合适的流动相pH值。
6.流量不稳定-流量不稳定可能是由于柱堵塞、进样器密封不良或流动相流速波动所致。
解决方案包括清洗柱、检查进样器密封情况或调整流动相流速稳定性。
7.进样量偏差-进样量偏差可能是由于进样器封堵、进样器针头磨损或进样器流速不稳定所致。
解决方案包括清洗进样器、更换进样器针头或调整进样器流速稳定性。
8.柱温度不稳定-柱温度不稳定可能是由于温控系统故障或环境温度变化所致。
解决方案包括检查温控系统是否工作正常或采取措施保持恒定环境温度。
这些是HPLC常见故障及其解决方案的例子。
在实际操作中,操作人员应该根据具体情况诊断和解决故障,并遵循相关的操作规程和安全操作指南。
解决高效液相色谱仪峰面积差别大的问题
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解决高效液相色谱仪峰面积差别大的问题高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是一种常用的分析技术,常被应用于生物、医药、环保等领域。
在分析样品的过程中,高效液相色谱仪(HPLC)峰面积的测定是重要的定量分析指标之一。
但是,在实际操作中常常会出现峰面积差别大的问题,如何解决这个问题呢?问题原因高效液相色谱仪(HPLC)峰面积差别大的问题,其原因往往有以下几个方面:1.进样量不准确:在进样过程中,如果进样量不准确,会导致样品浓度的不同,从而导致峰面积的差异。
2.柱温不稳定:柱子温度对柱子的分离效果有很大的影响,如果柱子温度不稳定,也会影响分离效果,从而导致峰面积的差异。
3.流速不一致:流速的不一致也会导致峰面积的差异。
4.进样器污染:进样器污染也会导致进样量不准确,从而导致峰面积的差异。
5.噪声的影响:噪声会干扰峰的测量,从而影响峰面积的测定。
解决方法针对峰面积差别大的问题,我们可以采取以下解决方法:1. 精确控制进样量精确的进样量可以保证样品的浓度一致,从而消除峰面积的差别。
在操作过程中,我们需要根据样品特性和分析需要来选择最佳的进样量,保证每次进样量的稳定性和准确性。
2. 稳定控制柱温保持柱温的稳定性也是消除峰面积差别的关键。
我们可以选用恒温水浴,或者恒温箱等方法来控制整个分离过程中的温度变化,从而消除温度对峰面积的影响。
3. 保持流速稳定流速的稳定对于分离和峰面积的测定都有很大的影响。
我们需要针对分析需要和进样量来设定流速,保持稳定的流速可以消除由流速不一致引起的峰面积差别。
4. 定期清洗进样器进样器的污染会导致进样量不准确,因此我们需要定期清洗进样器,保证进样器的干净卫生,消除进样器污染引起的峰面积差别。
5. 滤波减少噪声影响噪声对峰面积测定的影响是不可避免的,我们可以通过滤波的方式来减少噪声的干扰。
小结高效液相色谱仪峰面积差别大的问题对于分析结果的准确性和可靠性都有很大的影响,我们需要从进样量、柱温稳定、流速稳定、进样器污染以及噪声等方面来控制和优化分析过程,以消除高效液相色谱仪峰面积差别大的问题。
高效液相色谱仪压力不稳故障解析与检修示例
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高效液相色谱仪压力不稳故障解析与检修示例压力不稳是高压液相色谱仪(HPLC)最为常见的故障,其表现:①压力在一段时间逐渐变化(升高或降低);②压力瞬间变化(>3kg)。
总结原因不外乎以下四种情况:⑴有气泡;⑵漏液;⑶单向阀不良;⑷泵工作相位不正确。
对于①这种情况:一般是在开机的一段时间内出现,往往是流动相在色谱柱内还没有平衡好、柱箱温度还没有恒定。
这些都不属于仪器问题,只要多平衡一会就会稳定。
若使用的是梯度程序,由于流动相的比例正处在变化中,压力也会跟随变化。
对于第②种情况:通过下面几步分析,很快就可以确定原因。
首先排除气泡因素:气泡的产生是由于流动相中溶解了空气,在泵压的作用下空气会分离出来,气泡留在泵体内排不出去,它不仅影响到流量的准确,泵压也会不稳,这时我们只要打开排废阀,利用快速冲洗功能很快就能将气泡赶出。
为防止气泡产生,最好的办法就是使用在线脱气装置。
没有脱气机时,流动相要经过脱气处理。
超声波震荡是常用的除气泡方法,虽然简单但效果不佳,不妨将流动相用微孔滤膜多过滤两遍,利用真空泵的负压,将溶解在流动相中的空气释放出来,其效果要好些。
如果使用中我们发现,连接过滤头的输液管中有微小的气泡流动时,这说明过滤头有堵塞现象必须清洗,你可用10%的硝酸进行超声15分钟,如果还有气泡产生那就该换新滤头了。
其次,要检查的是输液泵有没有漏液现象,一般接在泵后的管道漏液会使压力降低,对压力稳定性影响不大。
如果泵内柱塞垫或柱塞杆磨损了那就不一样了,它不仅压力上不去、变化大、流量也不足。
只要观察到泵头或冲洗管漏液(有冲洗瓶时液位会升高),柱塞垫或柱塞杆肯定有问题。
第三是单向阀不良,当有盐份或者杂质等污染物附着在单向阀内球体和阀体表面时,就会破坏密封性,造成输液的单向性能降低,泵虽然在工作,但就是输送不好液体,严重时不能输液。
反映到压力上,表现为严重不稳或没有压力。
这时你可以卸下单向阀,用异丙醇超声清洗20分钟。
高效液相色谱技术中常见问题分析及解决方法
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更换。
仪器管路液体泄漏是导致系统压力不稳定的最
常见情况。 漏液严重时,仪器自身会发出系统压力
过低的警报。 轻微泄漏则可用干燥的餐巾纸擦拭管
路外部,观察纸巾是否被渗入液体进行判断。 泄漏
孔璐璐,等:高效液相色谱技术中常见问题分析及解决方法
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可能由管路松动或管路损坏引起,对于前者,重新拧
1. 1. 1 样品前处理不当
样品前处理不当可能会产生鬼峰,一般源于两
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个途径:一是所用试剂被污染;二是测试容器不干
净。 鉴别起来比较简单:使用试剂稀释样品,如果待
测样品出峰明显减小而鬼峰变化不大,则鬼峰源自
试剂污染。 如果洁净容器后重新检测鬼峰消失,则
鬼峰源自容器的污染。
1. 1. 2 流动相污染
的空气。 这种情况可预先将流动相进行超声脱气处
每次补充流动相时以直接补给的方式,没有对贮液
理,然后再装入储液瓶中待用。 二是由于水相和有
瓶进行清洗更换,富集的污染物就会进入到仪器流
机相的物理化学性质存在差异,两者在相互混合时,
路中产生鬼峰。
增加了空气在两种流动相中的溶解度。 对于这种情
上述问题的解决方法是更换流动相,即使用干净
样品的相溶性,如没有特殊原因,一般选择流动相作
留以及色谱柱和仪器管路中污染物的富集。
为待测组分的溶剂,以降低由于待测样品在流动相
在不改变测试条件情况下,如果鬼峰每次有规
中溶解性差引入的空气量。
律地出现在色谱图的相同位置,则污染很可能来自
液相色谱仪采用动态混合器和静态混合器将不
于自动进样器端。 这时可将自动进样针和针座拆
Key words: high performance liquid chromatography; common problems; influence factors;
高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法

8 2005.05高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法陈莲 高洪 肖啸(云南农业大学动物科学技术学院,云南 昆明 650201)高效液相色谱(high performance liquidchromatography, HPLC)技术是近30年发展起来的一种具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离分析技术。
它既能用于微量组分的分析测定,又能用于大量的制备分离,手段灵活多样,其应用范围已超过其它各种分离方法,尤其在生化医药样品的分析分离、食品卫生安全检验等方面更能充分发挥它的特长,为推动这些领域的进步和发展作出了巨大贡献。
液相色谱在使用过程中常会出现一些影响分析结果的小问题,如果使用人员了解了常见问题及其成因和相关解决方法,能做到早预防勤维护,使分析结果保持较好的稳定性与较高的精确性。
1 液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。
对于整个系统而言,色谱柱、泵和检测器是核心部件同时也是容易出事故的主要部件。
2 常见问题及解决方法2.1 针对柱压问题柱压变化是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的指标,柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效高低、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI(针对Waters高效液相色谱仪)之间。
压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题,但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动种类相关。
值得注意的是在使用梯度洗脱进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。
一般而言,柱压变化最先考虑的是柱子,在排除柱子因素后再考虑其它因素。
在实际应用中常见柱压问题可从以下几个方面来考虑(见表1)。
2.2 针对保留时间漂移的问题保留时间的改变是很多液相色谱仪使用者常碰到的问题,包括了保留时间的延长或缩短。
它的产生与很多因素有关,可从以下方面进行考虑(见表2)。
图1 液相色谱仪工作系统及流程2005.05 9更换新的色谱柱。
高效液相色谱仪常见故障及解决方法
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78宁夏农林科技,Ningxia Journal of Agri.and Fores.Sci.&Tech. 2020,61(11 ):78-80高效液相色谱仪常见故障及解决方法吴江瑞,马燕,黄燕,孔祥明,杜越,魏晓琴,李慧中卫市农产品质量安全检验检测中心,宁夏中卫755000摘要:高效液相色谱法在农产品检测领域发挥着重要作用。
文章分析了高效液相色谱仪在使用中常见故障产生的原因,提出了常见故障解决方法,以期为检测人员提供参考。
关键词:高效液相色谱;常见故障;解决方法中图分类号:0657.31 文献标识码:A文章编号:1002-204X(2020)11-0078-03doi:10.3969/j.issn.1002-204x.2020.11.027Analysis of HPLC Common Faults Causes and SolutionsWu Jiangrui, Ma Yan, Huang Yan, Kong Xiangming, Du Yue, Wei Xiaoqin, Li Hui(Zhongwei City Agricultural Products Quality Safety Detection and Testing Center,Zhongwei,Ningxia 755000) Abstract High performance liquid chromatography plays an important role in the detection and testing of agricultural products.In this paper,the causes of common faults during the application of HPLC were analyzed.The solutions were also put forward,aiming to provide references for more testing personnel.Key words HPLC;Common faults;Solutions高效液相色谱法是农产品质量安全控制过程中不可缺少的重要方法,具有分离速度快、检测效率高、重现性好等特点,尤其在检测极性较强、相对分子质量较大、不易气化或受热易分解的农药中更能显示其优越性[1-2]。
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法

高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法1 高效液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。
对于整个系统而言,柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。
2 常见问题及解决方法高效液相作为一种高精密仪器,如果在使用过程中不按照正确操作的话,就容易导致一些问题。
其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方,柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI(3.3 Bar)之间(在使用梯度洗脱时,柱压平稳缓慢的变化是允许的)。
压力过高、过低都属于柱压问题。
2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题,指的是压力突然升高,一般都是由于流路中有堵塞的原因。
此时,我们应该分段进行检查。
(1).首先断开真空泵的入口处,此时PEEK管里充满液体,使PEEK管低于溶剂瓶,看液体是否自由滴下,如果液体不滴或缓慢滴下,则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法:用30%的硝酸浸泡半个小时,在用超纯水冲洗干净。
如果液体自由滴下,溶剂过滤头正常,在检查;(2).打开Purge阀,使流动相不经过柱子,如果压力没有明显下降,则是过滤白头堵塞。
处理方法:将过滤白头取出,用10%的异丙醇超声半个小时。
如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下,过滤白头正常,在检查;(3).把色谱柱出口端取下,如果压力不下降,则是柱子堵塞。
处理方法:如果是缓冲盐堵塞,则用95%的水冲至压力正常。
如果是一些强保留的物质导致堵塞,则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。
假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降,则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上,用流动相冲洗柱子。
这时,如果柱压仍不下降,只有换柱子入口筛板,但一旦操作不甚,很容易造成柱效下降,所以尽量少用。
WATERSHPLC常见故障分析
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WATERSHPLC常见故障分析WATERSHPLC(高效液相色谱)是一种常用的分析方法,用于分离和检测化合物。
然而,HPLC仪器在使用过程中一些常见故障可能会影响分析结果和实验的进行。
在以下的文章中,我们将探讨一些WATERSHPLC常见故障的分析和解决方法。
1.峰形不对称峰形不对称可能是由于流动相、柱等问题引起的。
首先,检查流动相是否正确配置,确保使用的溶剂无气泡和杂质。
其次,检查柱的状态,尽量避免在柱上运行样品时破坏柱的封底。
最后,还可以尝试调整梯度和流速等参数以改善峰对称性。
2.噪声干扰噪声干扰可能是由于仪器的光电检测器或环境因素引起的。
首先,检查光电检测器是否干净,清洁检测器表面以去除灰尘和杂质。
其次,尽量将仪器放置在安静的环境中,避免外部噪声的干扰。
最后,检查样品制备的过程,确保样品中没有杂质或颗粒。
3.漏液漏液可能是由于柱连接不紧密或密封圈老化引起的。
首先,检查柱连接是否紧固,确保连接件没有松动。
其次,检查密封圈的状态,及时更换老化的密封圈。
最后,还可以尝试调整流速和压力以减轻压力对密封的影响。
4.柱堵塞柱堵塞可能是由于样品中的杂质、柱背压增加或柱老化引起的。
首先,可以尝试使用过滤器或微孔过滤膜将样品预处理,去除样品中的颗粒和杂质。
其次,检查流动相的组分,避免出现析出物或结晶。
最后,定期检查柱背压,及时更换老化的柱。
5.柱效降低柱效降低可能是由于柱老化、样品残留或流动相组分改变引起的。
首先,定期检查柱的状态,及时更换老化的柱。
其次,对于含有高糖、脂肪或盐的样品,可以考虑进行前处理或柱后处理以减轻柱效降低的影响。
最后,检查流动相的组分,确保流动相没有杂质和过多的溶剂。
总结而言,WATERSHPLC常见故障的分析和解决方法需要综合考虑多个因素,包括流动相、柱、样品和仪器等。
通过仔细检查和调整这些因素,可以解决大多数故障,并确保HPLC仪器的正常运行和准确的分析结果。
液相色谱使用注意及保养

高效液相色谱(HPLC)使用中常见故障及解决方法(一)峰型异常问题峰型问题是液相的主要问题,在做液相过程中,我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型,对于各种各样的异常峰,要区别对待,从主要问题出发,一个一个加以解决。
1、色谱图中未出峰。
解决方法:系统未进样或样品分解;泵未输液或流动相使用不正确;检测器设置不正确;针对以上情况成因作相应调整即可。
2、一个峰或几个峰是负峰。
解决方法:流动相吸收本底高;进样过程中进入空气;样品组分的吸收低于流动相。
3、所有峰均为负峰。
解决方法:信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒;光学装置尚未达到平衡。
4、所有峰均为宽峰。
解决方法:系统未达到平衡;溶解样品的溶剂极性比流动相差很多;色谱柱尺寸及类型选择不正确;色谱柱或保护柱被污染或柱效降低;温度变化造成的影响。
、5、所出峰比预想的小。
解决方法:样品黏度过大;进样品故障或进样体积误差;检测器设置不正确.定量环体积不正确;检测池污染;检测器灯出现问题。
6、出现双峰或肩峰。
解决方法:进样量过大;样品浓度过高;保护柱或色谱柱柱头堵塞;保护拄或色谱柱污染或失效;柱塌陷或形成短通道。
7、前伸峰。
解决方法:进样量或样品浓度高;溶解样品的溶剂较流动相极性强;保护柱或色谱柱污染或失效。
8、。
解决方法:柱超载,降低样品量;增加柱直径采用较高容量的固定相;峰干扰,对样品进行清洁过滤;调整流动相;硅羟基作用,加入三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值;柱内烧结不锈钢失效,更换烧结不锈钢;加在线过滤器,对样品进行过滤;死体积或柱外体积过大,将连接点降至最低;尽可能使用内径较细的连接管;柱效下降,更换柱子;采用保护柱,对柱子进行再生。
9、出现平头峰。
解决方法:检测器设置不正确;进样体积太大或样品浓度太高。
10、出现鬼峰。
解决方法:进样阀残余峰,在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统;样品中存在未知物,改进样品的预处理;流动相污染,更换新流动相,尽可能现配现用,隔夜的流动相再次使用时要过滤;尽可能使用HPLC级试剂;流路中有小的气泡,打开Purge阀,加大流速排除。
高效液相色谱基线的各种问题汇总

高效液相色谱基线的各种问题L、基线漂移原因解决方法1、柱温波动。
(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。
通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。
)1、控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器图2、流动相不均匀。
(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。
)2、使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。
流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。
如有需要,可以用1N的硝酸。
(不要用盐酸)4、检测器出口阻塞。
(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)4、取出阻塞物或更换管子。
参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化5、更改配比或流速。
为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢,特别是流动相发生变化时6、用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成7、检查流动相的组成。
使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂8、样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。
8、使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂,但检测器未调整。
9、重新设定基线。
当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
10、将波长调整至最大吸收波长处M、基线噪音(规则的)原因解决方法1、在流动相、检测器或泵中有空气1、流动相脱气。
冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液图2、见第三部分。
检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。
如有必要,更换泵密封。
3、流动相混合不完全3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂4、温度影响(柱温过高,检测器未加热)4、减少差异或加上热交换器5、在同一条线上有其他电子设备5、断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。
高效液相色谱法的常见问题及解决方法

高效液相色谱法的常见问题及解决方法高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法,这些方法在使用的过程中往往会遇到诸如鬼峰、基线漂移、拖尾、分叉峰、保留时间漂移、柱压过高等系列问题,如何解决这些问题呢?1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移,有时发生快速变化,原因何在?如何解决?关于漂移问题:①温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定;②流动相发生变化,解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等;③柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡;关于快速变化问题①流速发生变化,解决办法是重新设定流速,使之保持稳定;②泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出;③流动相不合适,解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合;2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?①筛板堵塞或柱失效,解决办法是反向冲洗柱子,替换筛板或更换柱子;②存在干扰峰,解决办法为使用较长的柱子,改换流动相或更换选择性好的柱子;③可能柱超载,减少进样量;3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法①样品量不足,解决办法为增加样品量;②样品未从柱子中流出。
可根据样品的化学性质改变流动相或柱子;③样品与检测器不匹配。
根据样品化学性质调整波长或改换检测器;④检测器衰减太多。
调整衰减即可;⑤检测器时间常数太大,解决办法为降低时间参数;⑥检测器池窗污染。
解决办法为清洗池窗;⑦检测池中有气泡。
解决办法为排气;⑧记录仪测压范围不当。
调整电压范围即可;⑨流动相流量不合适。
调整流速即可;⑩检测器与记录仪超出校正曲线。
解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线。
4.做HPLC分析时,柱压不稳定,原因何在?如何解决?①泵内有空气,解决的办法是清除泵内空气,对溶剂进行脱气处理;②比例阀失效,更换比例阀即可;③泵密封垫损坏,更换密封垫即可;④溶剂中的气泡,解决的办法是对溶剂脱气,必要时改变脱气方法;⑤系统检漏,找出漏点,密封即可;⑥梯度洗脱,这时压力波动是正常的。
高效液相色谱法分析中的常见问题与解决方案

高效液相色谱法分析中的常见问题与解决方案高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是一种现代化的分析方法,广泛应用于药物、食品、环境等领域。
然而,在实际应用过程中,常常会遇到一些问题。
本文将探讨高效液相色谱法分析中的常见问题,并提供解决方案。
1. 色谱峰分离不良在进行高效液相色谱分析时,首要问题就是色谱峰的分离不良。
造成这个问题的原因可能是样品组分过于复杂,或是色谱柱选择不当。
解决的方法包括:(1)优化样品前处理方法,如提取、净化等,以减少样品的复杂性;(2)调整流动相的组成和流速,或试用其他类型的色谱柱,以提高色谱峰的分离度。
2. 流动相持续泵出问题在HPLC分析过程中,流动相持续泵出是关键步骤之一。
当出现流量不稳定或持续泵出不工作的情况时,可以尝试以下解决方法:(1)检查管路是否有漏气现象,尤其是连接件的密封性;(2)清洗或更换柱子和过滤器,以防止堵塞;(3)检查、更换流量检测器,并校正流量计。
3. 柱寿命较短柱寿命的短暂是高效液相色谱法分析中常见的问题之一,主要原因是样品残留物的堆积、色谱柱废液的积累、和流动相的不合适。
针对这个问题可以采取以下措施:(1)对样品进行预处理,减少残留物的堆积;(2)定期清洗和维护色谱柱,保持柱的表面状况;(3)使用适当的流动相,避免酸性或碱性物质损害色谱柱。
4. 波峰畸变问题波峰畸变是指在色谱图上观察到的峰形呈现为不对称的情况,这可能是由于柱床不均匀、流量不稳定或是组分浓度过高引起。
解决这个问题的方法包括:(1)更换新的色谱柱,确保柱床的均匀性;(2)检查各部分的流量是否稳定,尤其是溶液的泵出和进样流速的稳定性;(3)适当稀释样品,以降低组分浓度。
5. 某些组分无法检测到当分析物无法检测到时,可以考虑以下解决方法:(1)确认所使用的检测器是否适用于分析物的检测,并检查检测器的灵敏度;(2)尝试使用其他检测器或改变检测器条件,如波长或电流;(3)检查样品制备方法是否完整,是否包含了分析物。
高效液相色谱仪器故障的诊断及其维修

高效液相色谱仪器故障的诊断及其维修液相色谱仪器是一种广泛应用于化学、生物和医药等领域的分离和分析仪器。
然而,由于长期使用或操作不当等原因,液相色谱仪器可能会出现故障。
本文将介绍一些常见的液相色谱仪器故障,并提供诊断和维修方法。
1. 压力异常当液相色谱仪器出现压力异常时,可能是由于柱堵塞或柱压力不足等原因引起的。
首先,可以检查柱是否堵塞,可以通过更换柱或者清洗柱来解决。
另外,也需要检查柱前的过滤器是否堵塞,如果是,则需要更换过滤器。
2. 泵故障液相色谱仪器的泵可能会出现泵头堵塞或密封件损坏等故障。
当出现这种情况时,需要检查泵头是否堵塞,并清洗或更换泵头。
另外,也需要检查泵的密封件是否完好,如果密封件损坏,则需要更换密封件。
3. 检测器信号异常检测器信号异常可能是由于检测器灯管老化或污染、检测器电路故障等原因引起的。
当出现这种情况时,可以先清洗检测器灯管或更换灯管;同时,也需要检查检测器电路是否正常,如果电路故障,则需要修复或更换电路。
总的来说,液相色谱仪器的故障诊断和维修需要具备一定的专业知识和技能。
在进行维修前,建议先查阅液相色谱仪器的使用说明书,了解其工作原理和结构,以便更好地诊断和解决故障。
同时,定期对液相色谱仪器进行维护和保养,可以有效地减少故障的发生,延长仪器的使用寿命。
液相色谱仪器(HPLC)是一种高效、精确的分析仪器,在化学、生物、药学等领域都有着广泛的应用。
然而,由于长期使用、操作不当或者设备老化等原因,液相色谱仪器也会出现各种故障。
在这种情况下,对仪器进行准确的故障诊断,并采取适当的维修措施,是保障仪器正常运行的关键之一。
4. 色谱柱问题液相色谱仪器中的色谱柱是重要的部件,若出现问题则会导致分离效果下降。
柱子可能会发生堵塞、损坏或老化,而影响分离效果。
如果怀疑柱子的问题导致了色谱仪器的故障,第一步就是检查柱子的状态。
可以通过更换柱子或者清洗柱子来解决这一问题。
此外,也要检查柱前的过滤器是否正常运行,如果过滤器故障,也会影响色谱仪器的运行。
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高效液相色谱HPLC常见问题分析2016-10-23来自网络1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移,有时发生快速变化,原因何在?如何解决?关于漂移问题:①温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定②流动相发生变化,解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等③柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题①流速发生变化,解决办法是重新设定流速,使之保持稳定②泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出。
③流动相不合适,解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?①筛板堵塞或柱失效,解决办法是反向冲洗柱子,替换筛板或更换柱子。
②存在干扰峰,解决办法为使用较长的柱子,改换流动相或更换选择性好的柱子③可能柱超载,减少进样量。
3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法①样品量不足,解决办法为增加样品量②样品未从柱子中流出。
可根据样品的化学性质改变流动相或柱子③样品与检测器不匹配。
根据样品化学性质调整波长或改换检测器④检测器衰减太多。
调整衰减即可。
⑤检测器时间常数太大。
解决办法为降低时间参数⑥检测器池窗污染。
解决办法为清洗池窗。
⑦检测池中有气泡。
解决办法为排气。
⑧记录仪测压范围不当。
调整电压范围即可。
⑨流动相流量不合适。
调整流速即可。
⑩检测器与记录仪超出校正曲线。
解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线。
4.做HPLC分析时,柱压不稳定,原因何在?如何解决?①泵内有空气,解决的办法是清除泵内空气,对溶剂进行脱气处理;②比例阀失效,更换比例阀即可;③泵密封垫损坏,更换密封垫即可;④溶剂中的气泡,解决的办法是对溶剂脱气,必要时改变脱气方法;⑤系统检漏,找出漏点,密封即可;⑥梯度洗脱,这时压力波动是正常的。
5.我最近更换了另一种牌号的ODS柱,虽然分离情况仍可以,但保留时间不能重现,为什么?这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。
尽管过去几年来,填料的制造技术有了极大的提高,但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。
正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。
因此,同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。
在流动相中加入少量竞争物,如三乙基胺(TEA),将会使硅醇基的成键能力饱和,从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。
如分离情况可以,系统稳定,达到系统适用性要求,就不必保留时间的重现。
6.我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高,请问为什么?柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。
其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的问题,您可按下面步骤检查问题的起因。
①拆去保护预柱,看柱压是否还高,否则是保护柱的问题,若柱压仍高,再检查;②把色谱柱从仪器上取下,看压力是否下降,否则是管路堵塞,需清洗,若压力下降,再检查;③将柱子的进出口反过来接在仪器上,用10倍柱体积的流动相冲洗柱子,(此时不要连接检测器,以防固体颗粒进入流动池)。
这时,如果柱压仍不下降,再检查;只用于使用过的柱子。
④更换柱子入口筛板,若柱压下降,说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质,正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。
若柱压还高,请与厂商联系。
一般情况下,在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题,SGE提供的Rheodyne7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
7.色谱双峰产生的可能及判断和处理HPLC分析中,在色谱柱正常,样品灵敏度足够,分析方法合适,色谱峰在出峰时间较短的条件下(不包括梯度),峰型应对称而尖锐。
但是,在对样品了解程度不够,方法不妥,样品处理方法及进样方式不合理下,会出现各种意想不到的问题,而对色谱峰难以作出合理的解释,尤其对于新手更是如此。
下面根据本人几年工作的体会,提出一些看法,向同仁指教。
色谱双峰指的是明是一种物质,但在色谱图中出现双峰,而表明含二种物质。
我将这种情况分为四种原因。
1色谱柱如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现(出峰越快,双峰的可能性会减少),尤其采用单一纯物质时,可以肯定色谱柱出问题-柱头受损或柱头固定相变脏或流失。
如果进样量少,原来色谱柱正常,色谱峰的形状多为一大峰带一小峰,不一定拖尾,这一般应是柱头受堵,将色谱柱反过来接,用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂,将堵在柱头的残留物冲掉,再反过来,一般情况下就行了。
当然不反冲,正冲有时也会正常的。
如果峰拖尾,双峰强弱相差不大,柱头固定相变脏或流失可能性更大,这是可以将进样那头拧开,将微孔滤片超声,柱头刮去一部分填料,重新填上新填料拧紧,不过这种活,需要一定技术,同时不能老干那种事,否则用不了几次,色谱柱就会应柱效很低而报废。
2溶剂极性及进样量许多HPLC分析者对此可能不以为然,一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容,而这确是双峰产生的一个很重要的原因。
目前HPLC分析多为反相色谱,流动相多为甲醇、乙腈、水,加各种添加剂以改善分离性能。
样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。
最佳的溶解方法是用流动相溶解,但是很多情况是不一致的。
当用溶剂极性强度大的试剂,如纯甲醇、纯乙腈,纯乙醇,而分析体系中以水为主,样品进样量大,如定量管为20ul,此条件下完全可以肯定,单一的纯物质出双峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一样),且拖尾,保留时间会提前(相对进样量少而言),将进样量减少一半以上,峰型将变为正常。
这是样品的溶剂与流动相极性相差太大,而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。
上面提到进样量造成双峰的一个原因,另一个原因是,进样量不一定大,但绝对量很大,色谱图上的双峰紧靠在一起,基本上齐高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色谱柱问题)。
将样品稀释再进样就可以了,这是由于进样量过大,色谱柱过载造成的。
3样品的特性有些样品由于其化学结构的特点,存在互变异构现象,而这种互变异构体无法分开,而是以一个动态平衡存在。
在色谱分析时,在一个特定的条件下,一种物质将出现双峰,双峰靠的很近,基本齐高,不拖尾,条件稍一变化,尤其pH,双峰现象将消失,如红霉素等。
有的样品紫外的色谱图上看不到双峰,但在LC-MS下,用质谱检测器,其质谱的总离子流图上较明显,例如我分析过的农药啶虫眯(吡虫清)。
4参数记录的参数一般都内定的,不必修改,但GC和HPLC的参数是不完全一致的,例如C-R3A数据记录仪上的一般记录时间间隔GC为2ms,HPLC为5ms,如果记录间隔时间缩短,一个峰将变为二个峰或更多。
8.色谱柱中的流动相会排干吗?不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形:不慎未及时补充流动相,泵将溶剂瓶中的流动相吸干了,HPLC系统由此而停止工作了。
如此情况是否会损坏色谱柱?泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了?色谱柱还能使用吗?事实上,如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干,并不会造成色谱柱的损坏。
即使泵中充满了空气,泵也不会将空气排入色谱柱。
因为泵只能输送液体,而不能输送空气。
相比之下,另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。
同样,整个色谱柱干涸的情况不太容易发生,多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了,因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。
即使色谱柱真的变干了,也不一定就不可救药了。
可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂(如经氦气脱气的甲醇)冲洗色谱柱以除去气体。
较低的表面张力有助于浸润填料表面;已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。
色谱柱大约需要(以1mL/min的流速)冲一个小时或更多的时间被彻底浸润,恢复到正常状态。
9.使用PEEK(polyetheretherketone)管路和接头需要注意什么问题?如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱,使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。
PEEK管路容易连接;PEEK接头不仅无需工具,手拧即可固定,而且容易调节锥箍之外的管路长度,方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。
使用此类材料的管路需要注意的是:PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。
虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象,但PEEK遇到上述溶剂会变脆。
另一个西药考虑的因素是压力限。
不锈钢管可耐受6000psi的压力,但PEEK管只能耐受近4000psi(但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi)。
使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能,因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。
但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管,因而压力太高时,可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。
10.液相色谱梯度洗脱中柱温的影响许多色谱工作者在操作液相色谱时,色谱柱是在室温环境下工作的。
如果实验室的温度能保持不变的话,不会有什么大问题。
但大多数的工作环境温度是不断变化的,因此若想将在某实验室开发的一种液相色谱方法应用到其他实验室的话,温度的差别就会引起较复杂的问题。
温度的影响在所有的色谱分析方式中都是存在的,本文就来讨论液相色谱方法中的梯度洗脱方式受温度影响的问题。
等度保留大多数色谱工作者知道等度洗脱时温度会影响保留时间。
图1显示了三个不同温度下的分离结果。
我们发现当温度升高时所有的色谱峰都前移了,等度洗脱时一般温度每升高一摄氏度保留时间会缩短1-3%,在图1中,保留时间变化率约为2%/℃。
拥有温控系统的实验室一般都有全天候温控设置,但这种设置可能引起室温显著变化,这对整夜运行的色谱系统就会有一些影响,例如我们实验室的夜间温度就设为4-7℃。
在不同的季节,实验室的夜间温度可能比正常工作日的温度高或低,这种温度的变化就会使色谱峰离开“保留时间窗”,造成连续进样中产生一系列的无效数据。
还有一个可能的温度影响因素就是色谱仪器在实验室的位置。
当色谱柱正对着空调的送风口时,虽然整个实验室的温度非常稳定,但色谱系统的温度就会不断的变化。
这就是我们要使用柱温箱的原因之一。
梯度保留温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是一样的。
图2是苯胺和苯酸在三个温度条件下的色谱图。
图1中,20℃的温度变化引起保留因子的变化大约为两倍,然而在图2中,40℃的变化使保留改变了约20%。
平均来说,图2中的色谱保留变化约为0.2%/℃。
由此可见,温度变化对梯度洗脱的影响要小于对等度洗脱的影响(假定本例具有普遍代表意义)。
即便如此,若梯度洗脱时不控制温度的话,保留值一般都会有较大的变化。
选择性的变化比较图1和图2会发现温度变化能引起选择性显著变化。
图1中,25℃时第二个峰和第一个峰很接近,但当温度升高后,第二个峰却远离第一个峰,接近第三个峰。
从三个图来看,对于前三个峰的最佳分离条件是35℃。
值得注意的一个有趣现象是,选择性的变化是和成分相关的,例如图1中当温度变化后最后三个峰的相对位置几乎不变。
在图2的梯度洗脱示例中,也有选择性变化。