酶的分离与纯化注意事项

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酶活
酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定:1个酶活力 单位是指在特定条件(25℃,其它为最适条件)下,在1分 钟内能转化1微摩尔底物的酶量,或是转化底物中1微摩尔的 有关基团的酶量。
酶的比 活力
1、在特定条件下,单位重量(mg)蛋白质或RNA所具有的酶 活力单位数。 2、比活力(性)(Specific Activity)是酶纯度的量度,即指: 单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数,一般用IU/mg蛋 白质来表示.一 般来说,酶的比活力越高,酶越纯.。 3、比活力 为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数,一般用 酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来 衡量酶的纯度,对于同一种酶来说,比活力越大,酶的纯度 越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋 白质的催化能力,是表示酶的纯度高低的一个重要指标。
提高温度,降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离,增大浓 度差等都有利于提高酶分子的扩散速度,从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活,在提取过程中还要注 意控制好温度、pH值等提取条件。
Hale Waihona Puke Baidu
酶提取过程中应注意事项 :
根据酶提取时,所采用的溶剂或溶液的不同, 根据酶提取时,所采用的溶剂或溶液的不同,酶抽提的 方法主要有盐溶液提取,酸溶液提取,碱溶液提取, 方法主要有盐溶液提取,酸溶液提取,碱溶液提取,有机 溶剂提取等。 溶剂提取等。 • 盐溶液提取: 盐溶液提取: • 大多数酶在一定浓度的盐存在条件下,酶的 大多数酶在一定浓度的盐存在条件下, 溶解度增加,即盐溶,但盐浓度不能太高, 溶解度增加,即盐溶,但盐浓度不能太高,否则溶解度反 而降低,即盐析。 一般采用稀盐溶液进行酶的提取, 而降低,即盐析。故:一般采用稀盐溶液进行酶的提取, 盐浓度控制在0.02 0.5mol/L。 盐浓度控制在0.02—0.5mol/L。 0.02 0.5mol/L • 例如:用固体发酵生产的麸曲中的α--淀粉酶 淀粉酶, 例如:用固体发酵生产的麸曲中的α--淀粉酶, 糖化酶、蛋白酶等胞外酶, 0.15mol/ 糖化酶、蛋白酶等胞外酶,用0.15mol/L的氯化钠溶液或 0.02~0.05mol/L的磷酸缓冲液提取;酵母醇脱氢酶用 0.02~0.05mol/ 的磷酸缓冲液提取; 0.5~0.6mol/ 的磷酸氢二钠溶液提取;有少数酶, 0.5~0.6mol/L的磷酸氢二钠溶液提取;有少数酶,如霉 菌产生的 •
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程,约可分为 的纯化过程, 个阶段: 三个阶段: (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质 抽出全蛋白, 打破细胞 → 抽出全蛋白, 沉淀法 多使用 盐析沉淀法;可 以粗略去除蛋白质以外的 物质。 物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化, 初步的纯化,使用各钟 析法。 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶 一步精制纯化, 的进一步精制纯化,可用 制备式 HPLC。 制备式电泳 或 HPLC。
在酶的分离纯化过程中为什么进行酶活力及酶比活力测定
1、防止酶变性失活。一旦活力明显下降,就要考虑换一种纯 化方法;
2、计算纯化效率。通过总活力和比活,评估纯化效率,寻找 最佳方法。
酶的分离与纯化注意事项及酶分离纯化 为什么进行酶活力和酶比活力测定
PPT制作:陈玉成,金昱 资料查找:郭姗姗 PPT讲解:田恩平
酶的提取、 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 离心分离,过滤分离, 离心分离,过滤分离,沉淀分 层析分离,电泳分离, 离,层析分离,电泳分离,萃 取分离,结晶分离等。 取分离,结晶分离等。 动物、 动物、植物或微生物细胞 发酵液
本章 目录
酶的提取: 酶的提取:
酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶剂或溶液处理含酶 原料,使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质 选择适当的溶剂。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂。 酶的结构和溶解性质, 一般说来,极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非 极性的有机溶剂中,酸性物质易溶于碱性溶剂中,碱性物质易 溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水,通常可用水或稀酸 稀碱、 酶都能溶解于水,通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行 水或稀酸、 提取,有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团,则可用有 提取,有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团,则可用有 机溶剂提取。
在酶的提取过程中,为了提高提取率并防止酶变性 失活,须注意以下几点:
1.温度: 温度: 通常抽提温度应控制在0 10oC( oC)。对某些耐温的酶, )。对某些耐温的酶 通常抽提温度应控制在0-10oC(0-4 oC)。对某些耐温的酶,如胃蛋 白酶等,可适当提高抽提温度, oC下保温抽提 效果较好。 下保温抽提, 白酶等,可适当提高抽提温度,在37 oC下保温抽提,效果较好。因 为提高温度、可提高酶的扩散速度,增加酶的溶解度, 为提高温度、可提高酶的扩散速度,增加酶的溶解度,有利于酶的提 取。 2.试剂 2.试剂 接着要注意的就是避免使用一些会造成酶变性的试剂, 接着要注意的就是避免使用一些会造成酶变性的试剂,比如说重金属 有机试剂。严格意义上来说,要提取活性酶, 盐,有机试剂。严格意义上来说,要提取活性酶,任何可能使蛋白质 沉淀的试剂和方法都要避免使用。最好就是直接在液体环境下进行, 沉淀的试剂和方法都要避免使用。最好就是直接在液体环境下进行, 比较理想的方法就是色谱柱层析。然后, 比较理想的方法就是色谱柱层析。然后,实际上为了防止蛋白质在提 取过程中被释放的内源性蛋白酶(木瓜蛋白酶,枯草蛋白酶等等) 取过程中被释放的内源性蛋白酶(木瓜蛋白酶,枯草蛋白酶等等)降 解蛋白质,还需要在提取环境中加入适当的蛋白酶抑制剂。 解蛋白质,还需要在提取环境中加入适当的蛋白酶抑制剂。
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