Lipofectamine 2000转染说明

Lipofectamine TM 2000
CAT. NO. 11668-027 Size: 0.75ml
CAT. NO. 11668-019 Size: 1.5 ml
4℃储存（不要冻存）
说明：
Lipofectamin TM 2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点：
●对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在 的细胞
系数据库中有各种细胞转染成功的实例。

●在含有或是不含有血清的培养基中，DNA- Lipofectamin TM 2000复合物能够直接加给细
胞。

●在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养4-6小时后需要除去
复合物。

关于转染的一些重要建议：
1.不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。

在/rnai
上有转染步骤，登陆后点击说明。

2.对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(μg)与Lipofectamine TM2000(μl)的比例
在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。

注意：在混合之前，我们建议用
Opti-MEM I 低血清培养基（Cat: NO.31985-062）（reduced serum medium）稀释
Lipofectamine TM 2000和DNA.
3.为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞
最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化
混浊度。

此外，在实验过程中保证相同的接种条件。

4.为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。

5.由于一些无血清复合物（如CD239、SFM II、VP-SFM）会抑制阳离子脂质体介导
的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和Lipofectamine TM 2000的相容性。

转染步骤（用于DNA）：
按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。

对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。

步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。

1.贴壁细胞：转染的前一天，在500μl无抗生素培养基中接种0.5-2×105个细胞，以保
证在转染时候细胞的混浊度达到90%-95%。

悬浮细胞：在准备转染混合物时，每500μl无抗生素培养基中含有细胞数量为4-8×105。

2.对于每个转染样品，按下面的方法准备：
a、在50μl无血清Opti-MEM I 低血清培养基中（或是其它无血清培养基）稀释DNA，
并轻轻混匀。

b、使用前轻轻混匀Lipofectamine TM 2000，然后取相应的量稀释在Opti-MEM 培养基中。

室温下静置5分钟。

注意：要在30分钟内混合Lipofectamine TM 2000和DNA的稀
释液。

c、室温下静置5分钟后，混合Lipofectamine TM2000和DNA的稀释液（总体积为
100μl）。

轻轻混匀并在室温下静置20分钟（溶液混合后可能会看上去浑浊）。

注
意：混合物在室温下的6个小时内不会失效。

3.细胞板的每个孔中加混合液100μl，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液
混匀。

4.检测目的基因的表达情况前，细胞于37℃ CO2培养箱中培养18-48小时。

此时不需要
改变培养基，但4-6小时后也许需要更换.
5.对于固定的细胞系：转染24小时后将细胞以1：10（或更高的稀释度）稀释度转移到
新鲜的生长培养基中。

如果需要的话，在以后的培养中可以在培养基中加入选择培养基。

对于悬浮的细胞系：转染4小时后，如果需要，加入PMA和/或PHA以提高CVM启动子的活性并促进基因表达。

转染量度标准：
在不同的组织培养板中转染细胞时，根据相对的表面积，按比例加入Lipofectamine TM 2000、细胞、和培养基，具体情况剪下表。

在自动、高产率体系中，建议96孔板的转染混合物的体积为50μl。

注意:操作时，可以直接将细胞混入转染混合物中进行快速的96孔板转染。

在细胞板中准备好转染混合物，然后直接加入说明中正常100μl体积时浓度的2倍浓度细胞培养液。

在转染混合液存在情况下，细胞可以正常的贴壁。

注意：表面积是根据培养容器的实际测量得到，但也会根据容器生产商的不同发生变化。

优化转染：
为了得到高的转染效率和低的无用副效应，通过改变细胞浓度、DNA以及Lipofectamine TM2000的浓度来优化转染条件。

另外，要保证细胞培养基的细胞混浊度高于90%，DNA(μg)与Lipofectamine TM（μl）2000的比例在1：0.5到1：5之间。