分子发光光谱法
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二、激发光谱和发射光谱
固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波 长，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系作图， 得到激发光谱曲线。
选择最大激发波长作为激发光波长，然后测定不 同发射波长时所发射的荧光或磷光强度，得到荧光或 磷光光谱曲线。
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1
13
三、分子荧光参数 1．量子产率 又称荧光效率
1
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三、荧光与分子结构的关系
• 物质只有吸收了紫外可见光，产生 * n *跃迁， 产生荧光
• *与n *跃迁相比，摩尔吸收系数大，寿命短 • *跃迁常产生较强的荧光， n *跃迁产生的荧
光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光 • 一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物是最
强最有用的荧光体
1
2
• 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分 为以下几类：
荧光—荧光分析法
光致发光：以光源来激发而发光 磷光—磷光分析法
化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析
法
电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光
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二、分子荧光分析法的特点
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400 350
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• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发 生荧光
• 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定
• 3，4 - 苯并芘是强致癌物
ex = 386 nm em = 430 nm
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2. 刚性平面结构——— 较稳定的平面结构
• 具有强荧光的分子多数有刚性平面结构
-o
o
o
-o
o
coo -
coo -
荧光素：氧桥把两 个环固定在一个平 面上，具有平面结 构，强荧光物质
2021/2/4
酚酞：无氧桥把两 个环固定，不能很 好的共平面，为非 荧光物质
1
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例 1，2 - 二苯乙烯
H
H
C=C
H C=C H
顺式：非平面构型 非荧光体
反式：平面构型 强荧光体
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3. 金属螯合物的荧光
• 大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物 都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定
• 不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与Mn+形成螯合 物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光
• 例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+— Al3+、Mg2+形成螯 合物后，能形成刚性结构，荧光加强
4. 外转换：激发分子通过与溶剂或其他溶质分子间的相互作用 使能量转换，而使荧光或磷光强度减弱或消失的过程。这一现 象又称为“熄灭”或“淬灭”。
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振动驰豫
S2
S1 系
间
内转换
跨 跃
T1
外转换
S0 λ1 吸光
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λ2 λ3 吸光 荧光
1
S0 λ4 磷光
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荧光发射：当分子处在单重态的最低振动能层时， 去激发过程是以10-7～10-9s左右的时间内发射一个光 子回到基态。
分子发光光谱法
§5.1 概述
一、分子发光分析法及其分类
• 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发
态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分
子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析
法。
较高激发态
吸收能
光辐射
量受激
退激
基态
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
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磷光发射：激发态分子经过系间跨跃到激发三重态 后，并经过迅速的振动驰豫到达第一激发三重态 （T1）的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子 返回基态。 磷光的寿命比荧光的要长得多
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• 从图中看出 • 磷＞ 荧＞ 激 * 易产生荧光 n * 易产生磷光
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OH N
M OH
N
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4. 取代基的类型
• 对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类： （1）增强荧光的取代基 —— 有 -OH、-OR、 -NH2、
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1. 共轭体系——有较强的荧光
• 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭程度越大， 越易产生荧光; 环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长， 发射的荧光强度越强
f
ex /nm
em /nm
苯
0.11
205
278
萘
0.29
286
310
蒽 菲
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0.46
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线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
一、荧光和磷光的产生
激发态分子在跃迁回到基态的过程中将多余的能 量以光子形式辐射出来，这种现象称为“发光”
激发单重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中不发生自 旋方向的变化。用S0、S1、S2分别表示分子的基态、第 一和第二激发单重态。
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激发三重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中伴随着电 子自旋方向的变化。用T1、T2分别表示分子第一和第二 激发三重态。
• 比较容易排除其它物质的干扰，选择性好
3. 实验方法简单
4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广
• 具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物， 广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧
产品分析、卫生检疫等领域。
• 荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法
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§5.2 分子荧光和磷光的基本原理
1. 灵敏度高 • 荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强
度，可提高荧光强度
激发
激发光
物质
强 发射荧光 强
采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度， 检测限荧光分析法比分光光度法低2~4个数量级
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2. 选择性好
• 不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发 光波长
• 不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光 波长
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1. 振动弛豫: 它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转移 至低振动能级的无辐射跃迁过程。
2. 内转换: 是指两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时， 常发生电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迂过程。
3. 系间跨越: 不同多重态间的无辐射跃迁，同时伴随着受激电子 自旋状态的改变，如S1→T1。
物质分子的荧光产率必然由激发态分子之活化 过程的各个相对速率决定：
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2．荧光寿命
荧光寿命是指停止激发之后，荧光强度降到最大强度的1/e 所需要的时间，常用τ表示。
It I0et/
I0，It分别表示在时间0和t时的荧光强度。
利用荧光寿命，可以进行荧光混合物分析。
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二、激发光谱和发射光谱
固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波 长，根据所测得的荧光强度与激发光波长的关系作图， 得到激发光谱曲线。
选择最大激发波长作为激发光波长，然后测定不 同发射波长时所发射的荧光或磷光强度，得到荧光或 磷光光谱曲线。
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三、分子荧光参数 1．量子产率 又称荧光效率
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三、荧光与分子结构的关系
• 物质只有吸收了紫外可见光，产生 * n *跃迁， 产生荧光
• *与n *跃迁相比，摩尔吸收系数大，寿命短 • *跃迁常产生较强的荧光， n *跃迁产生的荧
光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光 • 一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物是最
强最有用的荧光体
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• 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分 为以下几类：
荧光—荧光分析法
光致发光：以光源来激发而发光 磷光—磷光分析法
化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析
法
电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光
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二、分子荧光分析法的特点
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• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发 生荧光
• 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定
• 3，4 - 苯并芘是强致癌物
ex = 386 nm em = 430 nm
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2. 刚性平面结构——— 较稳定的平面结构
• 具有强荧光的分子多数有刚性平面结构
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荧光素：氧桥把两 个环固定在一个平 面上，具有平面结 构，强荧光物质
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酚酞：无氧桥把两 个环固定，不能很 好的共平面，为非 荧光物质
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例 1，2 - 二苯乙烯
H
H
C=C
H C=C H
顺式：非平面构型 非荧光体
反式：平面构型 强荧光体
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3. 金属螯合物的荧光
• 大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物 都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定
• 不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与Mn+形成螯合 物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光
• 例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+— Al3+、Mg2+形成螯 合物后，能形成刚性结构，荧光加强
4. 外转换：激发分子通过与溶剂或其他溶质分子间的相互作用 使能量转换，而使荧光或磷光强度减弱或消失的过程。这一现 象又称为“熄灭”或“淬灭”。
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振动驰豫
S2
S1 系
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内转换
跨 跃
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外转换
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S0 λ4 磷光
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荧光发射：当分子处在单重态的最低振动能层时， 去激发过程是以10-7～10-9s左右的时间内发射一个光 子回到基态。
分子发光光谱法
§5.1 概述
一、分子发光分析法及其分类
• 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发
态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分
子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析
法。
较高激发态
吸收能
光辐射
量受激
退激
基态
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
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磷光发射：激发态分子经过系间跨跃到激发三重态 后，并经过迅速的振动驰豫到达第一激发三重态 （T1）的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子 返回基态。 磷光的寿命比荧光的要长得多
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• 从图中看出 • 磷＞ 荧＞ 激 * 易产生荧光 n * 易产生磷光
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OH N
M OH
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4. 取代基的类型
• 对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类： （1）增强荧光的取代基 —— 有 -OH、-OR、 -NH2、
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1. 共轭体系——有较强的荧光
• 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭程度越大， 越易产生荧光; 环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长， 发射的荧光强度越强
f
ex /nm
em /nm
苯
0.11
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萘
0.29
286
310
蒽 菲
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线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
一、荧光和磷光的产生
激发态分子在跃迁回到基态的过程中将多余的能 量以光子形式辐射出来，这种现象称为“发光”
激发单重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中不发生自 旋方向的变化。用S0、S1、S2分别表示分子的基态、第 一和第二激发单重态。
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激发三重态：分子吸收能量后，在跃迁过程中伴随着电 子自旋方向的变化。用T1、T2分别表示分子第一和第二 激发三重态。
• 比较容易排除其它物质的干扰，选择性好
3. 实验方法简单
4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广
• 具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物， 广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧
产品分析、卫生检疫等领域。
• 荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法
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§5.2 分子荧光和磷光的基本原理
1. 灵敏度高 • 荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强
度，可提高荧光强度
激发
激发光
物质
强 发射荧光 强
采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度， 检测限荧光分析法比分光光度法低2~4个数量级
2021/2/4
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4
2. 选择性好
• 不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发 光波长
• 不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光 波长
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1. 振动弛豫: 它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转移 至低振动能级的无辐射跃迁过程。
2. 内转换: 是指两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时， 常发生电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迂过程。
3. 系间跨越: 不同多重态间的无辐射跃迁，同时伴随着受激电子 自旋状态的改变，如S1→T1。
物质分子的荧光产率必然由激发态分子之活化 过程的各个相对速率决定：
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2．荧光寿命
荧光寿命是指停止激发之后，荧光强度降到最大强度的1/e 所需要的时间，常用τ表示。
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I0，It分别表示在时间0和t时的荧光强度。
利用荧光寿命，可以进行荧光混合物分析。
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