乳鼠窦房结细胞 、心房肌细胞及心室肌细胞动作电位比较

乳鼠窦房结细胞、心房肌细胞及心室肌细胞动作电位比较陈茜;王容;项国剑;李泱;林风辉;张建成

【摘要】目的研究乳鼠窦房结细胞、心房肌细胞及心室肌细胞的动作电位.方法选12只新生24 h内的Wistar大鼠乳鼠,分离培养窦房结细胞、心房肌细胞和心室肌细胞,运用全细胞膜片钳技术记录动作电位.结果窦房结细胞体积小,细而长,呈长梭形,搏动频率为(152.1±10.9)min-1;心房肌细胞体积亦较小,梭形或三角形,搏动频率为(116.3±8.6)min-1;心室肌细胞体积较大,可伸出伪足并交织成网,呈短梭形、多角形或不规则形,搏动频率为(92.4±9.3)min-1,3种细胞的搏动频率差别均有统计学意义(P<0.01).3种细胞的静息电位分别为(-41.3±4.0),(-50.7±2.9)及(-

59.8±2.1)mV,差别无统计学意义(P>0.05).心室肌细胞的APD20,APD50和

APD90均较心房肌细胞延长,差别具有统计学意义(P<0.05).结论 3 种细胞形态各异 ,窦房结细胞具有自发性搏动 ,心室肌细胞动作电位时程较心房肌细胞长 .

【期刊名称】《福建医科大学学报》

【年(卷),期】2018(052)004

【总页数】5页(P220-224)

【关键词】窦房结;肌细胞,心脏;动作电位;电生理学

【作者】陈茜;王容;项国剑;李泱;林风辉;张建成

【作者单位】福建省立医院,福建医科大学省立临床医学院重症医学四科,福州350001;福建省立医院,福建医科大学省立临床医学院干部特诊一科,福州350001;福建省立医院,福建医科大学省立临床医学院心内科,福州350001;中国人民解放军总医院心内科,北京100853;福建省立医院,福建医科大学省立临床医学院重症医学

四科,福州350001;福建省立医院,福建医科大学省立临床医学院心内科,福州350001

【正文语种】中文

【中图分类】R-332;R322.11;R329.25;R337.5;R341

心脏实现泵血功能是以心肌的收缩和舒张为基础的，心脏之所以能不停地进行有序的、协调的收缩与舒张交替的活动，归根结底都是由心肌细胞动作电位(action potential, AP)的规律性发生与扩布引起的。窦房结是心脏正常窦性节律的起搏点，窦房结细胞具有强大的自律性，可以自发、有节律地搏动。心脏的正常搏动由窦房结组织产生，并按传导组织的顺序依次通过结间束抵达房室结及心房肌，后通过希氏束、浦肯野纤维使全部心室肌几乎同时被激动，从而引起心肌细胞有节律地收缩和舒张。

已知心肌细胞主要由4类细胞组成，包括心室肌细胞(ventricular cell, VC)、心房肌细胞(atrial cell, AC)、窦房结细胞(sino-atrial node cell, SNC)[包括移行细胞(T-细胞)和起搏细胞(P-细胞)]和浦肯野纤维。前二者是工作细胞，具有稳定的静息电位，主要执行收缩功能，在4相的静息期无自动去极化功能。而窦房结细胞是

自律性细胞，它们组成心内特殊传导系统，这类细胞大多没有稳定的静息电位，在4相的最大舒张期可以发生缓慢自动去极化，并可自动产生节律性兴奋。目前，乳鼠和成年大鼠心肌细胞被用于药物干预、缺氧复氧损伤、疾病模型离子通道改变等方面的研究，但成年大鼠心肌细胞分离后无法传代和长时间培养，只能用于即时及短时间研究，限制了干预[1-3]，而乳鼠心肌细胞由分离培养后获得，数量多，对

乳鼠心肌细胞膜AP的认识有利于今后进行模型构建、药物干预等较长时间的研究。为此，本研究采用全细胞膜片钳技术，观察乳鼠窦房结细胞、心房肌细胞及心室肌

细胞的AP，并进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物新生24 h内Wistar大鼠15只，清洁级，雌雄不拘，SPF级[斯贝福(北京)实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK(京)2011-0004]，质量检测单位：中国食品药品检定研究院。

1.1.2 试剂与溶液 DMEM细胞培养基、PBS磷酸盐缓冲液(美国Thermo公司)；FBS胎牛血清(美国Invitrogen公司)；HEPES缓冲液(美国Amresco公司)；青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司)；Trypsin(中国Hotaibio公司)；NaCl，KCl，NaHCO3，MgCl2·6H2O，Na2ATP，K-aspartate，CaCl2，Na2ATP及

葡萄糖(美国Sigma公司)。

记录单细胞AP的细胞外液(mmol/L)配方：NaCl 140，KCl 4，MgCl2·6H2O 1.0，HEPES 10，Glucose 5，CaCl2 1.0；pH值用NaOH调至7.36。记录单细胞AP 的电极内液(mmol/L)配方：K-aspartate 120，KCl 20，MgCl2·6H2O 1.0，

Na2ATP 4，HEPES 10，Glucose 10；pH值用KOH调至7.30。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌细胞的急性分离与培养方法 (1)取材：乳鼠体表用75%酒精反复浸

泡数秒后，呈仰卧位固定四肢于泡沫上，消毒胸腹部皮肤，沿胸骨右缘剪开并去除前胸壁，暴露心脏，置于解剖显微镜下分离心包膜，将心脏向右下方轻轻牵拉，轻移右心耳，看清上腔静脉，于界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部取0.7 mm×0.7 mm×0.7 mm的组织块，同时剪取心房组织及心室中下1/3处，立即置于预冷的不含血清的DMEM培养液；(2)冲洗：将组织培养皿置于超净台中，用滴管反复

轻柔吹打组织，洗去部分残留血液后，再次将组织块移入PBS液中反复吹打冲洗，直至洗净；(3)消化：将清洗后的组织块移入消毒过的青霉素小瓶内，用眼科剪将

组织块剪碎成0.5～1.0 mm3的乳糜状小块，加入体积为组织块30～50倍的

0.08%的胰酶，用吸管轻柔吹打0.5 min，自然沉淀后弃上清液。再加入0.08%的胰酶(体积同上)，置于37 ℃水浴中轻轻振荡3～5 min，吹打0.5 min，自然沉淀，吸取上清液，加入等体积的10% FBS培养基终止消化，重复消化3～5次，至基

本消化成单细胞为止；(4)过滤、离心：将细胞悬液用400目金属滤网过滤后分装

于15 mL的离心管中离心，940 r/min下离心6 min，弃上清液；(5)接种培养：每根15 mL离心管用含10% FBS培养基重悬后，将单细胞悬液接种于60 mm的培养皿内，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中孵育90 min；(6)采用差速贴壁法分离技术，因成纤维细胞贴壁快，培养皿中的细胞悬液即为较纯化的心肌细胞，轻轻吸出培养皿内的细胞悬液，分装于6个35 mm的培养皿内，放回培养箱继续孵育，每天换液1次，以备膜片钳记录用。

1.2.2 膜片钳记录方法及刺激参数的设置选取细胞膜完整、表面光滑、横纹清晰的心肌细胞检测AP。采用全细胞膜片钳记录的方法，将膜片钳放大器(Axonpatch 700B，美国Axon公司)与计算机连接，应用数模转换器(Digidata 1440A，美国Axon公司)采集刺激信号及电压输入信号，此过程由Clampfit-9.2软件控制调节。GG-17玻璃毛坯经微电极拉制仪(pp-83，日本Narishige公司)经两步法拉制成电阻为3.0～5.0 MΩ的微电极，常规安装电极并调整方向，调节三维微操纵器，使

微电极头端进入细胞外液，在显微镜下观察电极的位置，缓慢移动，使其与细胞膜进行封接，电极电阻上升0.5～1 MΩ时停止移动，通过注射器给电极施加负压，使封接电阻达1 GΩ或以上，吸破细胞膜成为全细胞记录模式，信号经截止频率为1 kHz的四阶贝塞尔低通滤波器，采样频率为5 kHz。将膜片钳设定为电流钳模式，记录窦房结细胞AP时不给予刺激，记录心房肌及心室肌细胞膜AP时给予2.5 ms、1 000 pA、1.0 Hz的外向电流，诱导并记录心室肌单细胞AP。

1.3 统计学处理数据以表示，采用pCLAMP 9.2进行图形采集和Origin软件进行