膜片钳原理

膜片钳技术原理

可兴奋膜的电学模型

细胞膜由脂类双分子层和和蛋白质构成。脂质层的电导很低，由于双分子层的结构特点，形成了细胞的膜电容，通道蛋白的开闭状况主要决定了膜电导的数值。在细胞膜的电学模型中，膜电容和膜电导构成了一个并联回路。在细胞膜的电兴奋过程中，脂质层膜电容的反应是被动的，其电流电压曲线是线性的；而由通道蛋白介导的膜电导构成了膜反应的主动成分，它的电流电压关系是非线性的。

当改变跨膜电位时，膜电容和膜电导分别引发被动和主动电流：Im=Ii＋CdV/dt，其中Im是流过膜的总电流，Ii是通道电流，CdV/dt是由膜电容介导的电容电流。为了考察通道电流就必须消除电容电流的影响，此时可以令dV/dt＝0，即将膜电位钳制在一固定数值，使其不随时间变化，这就是电压钳技术的实质所在。

电压钳技术

离子通道的近代观念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代的开创性研究。在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Cole等人在1939年进行的高频交变电流测量实验表明，当动作电位被触发时，虽然细胞的膜电导大为增加，但膜电容却只略有下降，这个事实表明膜学说所宣称的膜破裂的观点是不可靠的。1949年Cole在玻璃微电极技术的基础上发明了电压钳位（voltage clamp technique）技术，基本原理如下：

电压钳技术的核心在于将膜电位固定在指令电压的水平，这样才能研究在给定膜电位下膜电流随时间的变化关系。在上图中，膜电位Vm由高输入阻抗的电压跟随器所测量。钳制放大器在比较了膜电位和指令电位E之后，通过电阻Ra将电流注入膜内以控制膜电位。钳制放大器的输出：Vo=A（E－Vm），因为这个输出由电阻Ra和膜所分压，所以输出电流：I=（Vo－Vm）/Ra。由这两个关系可推出：Vm=EA/(1+A)-RaI/（1+A）。因此若钳制放大器的增益A极大，膜电位Vm和指令电位E之间的差别就可以忽略，即实现了电压钳制。

Hodgkin、Huxley和Katz应用电压钳技术研究枪乌贼巨轴突，结合同位素示踪和胞内灌流等技术发现：动作电位的初期，细胞膜主要对钠离子的通透性发生改变，胞外的钠离子迅速内流，并产生所谓的“超射”现象（overshoot）；随后对钠的通透性的急剧减少并且对钾离子的通透性增加。兴奋期的膜电位存在“超射”现象也是膜学说所不能解释的。

根据这些实验，Hodgkin、Huxley和Katz在其1949—1952年的一系列论文中提出了“离子学说”或“钠学说”。认为当膜的去极化超过一个临界值时，就会触发动作电位的产生。在此期间，钠电导迅速上升，钠离子大量内流，使得膜电位接近钠的平衡电位；随后钠电导迅速失活，钾电导逐渐增加，引起膜电位的复极化。

Hodgkin和Huxley通过对电压钳位实验数据的分析，给出了所谓的Hodgkin—Huxley方程。他们将膜电位钳制在不同的水平，观察钾电导或钠电导随时间的变化，然后用一个常微分方程去逼近所得到的实验曲线，而这些微分方程中的参数则假定跟离子通道上的“粒子”相关。根据H—H方程，能够推导出动作电位的阈值、形状、幅度等性质。并且在去除电压钳制的条件下，可以得到一个以电压和时间为变量的偏微分方程，由它可以给出和真实状况相符合的神经冲动的传导。

膜噪声和噪声分析

Katz等人在1970年代初期研究了蛙神经肌肉接头处肌纤维膜电位的波动。他们根据对这种膜电位“噪声”的分析，提出了量子释放的概念，认为神经递质是以囊泡的形式从突触前膜释放到突触间隙中。并且Katz等人借助这种新的“噪声分析”方法（fluctuation analysis），能从突触后膜电位的“噪声”中推测出单位事件的幅度和时程。Anderson、Stevens、Colquhoun和Sigworth等人进一步发展了“噪声分析”。

“噪声分析”的实质在于二项分布期望和方差之间的关系。假定通道只有开和关两个状态，并且各个通道的开关是独立的。若N是通道的总数，p是通道的开放概率，i是单通道电流，I是膜电流的期望值。则有：I=Npi，var(I)=Np(1-p)i2,即：var(I)=iI-I2/N。用var(I)对I作图，这显然是一个开口朝下的抛物线。微分这个二次方程得到曲线的斜率：dvar(I)/dI=i-2I/N,当I=0时的斜率就是单通道电流，根据钳制电位和反转电位之间的差就可以算出单通道电导；在抛物线的顶点即当：dvar(I)/dI=0时，I=Ni/2，由此可算出

离子通道的总数。

膜片钳技术

“噪声分析”只能推算离子通道的电导和时间弛豫过程，而不能直接观测通道的门控动力学。1976年德国马普学会生物物理化学研究所（Göttingen）的两位科学家，Neher和Sakmann在电压钳技术的基础上创立了膜片钳技术（patch clamp technique）。“膜片钳”的本意就是对小片细胞膜进行电压钳位，然后观测通过这一小块膜片上单个离子通道的电流。其电路原理示意图如下：

膜片钳技术的基本原理是通过负反馈使得膜电位与指令电压相等，在电压钳制的条件下记录膜电流。上面是电阻反馈式膜片钳放大器的电路示意图。A1为一极高输入阻抗、极低噪声的场效应管运算放大器，由于A1极高的开环增益使得两个输入端的电压几乎完全相等，从而实现电压钳制。Rf为一数值可切换的反馈电阻，分别对应于不同的电流记录范围，其中高值反馈电阻具有极高的电阻和极低的杂散电容，是决定放大器单通道记录性能的基本元件。A2为一差分放大器，它的输出即为电极电流和反馈电阻的乘积。由放大器A1和A2构成的回路称为电流—电压转换器，是膜片钳放大器前级（headstage）的核心。

Rs是由电极和细胞之间的通路所构成的串联电阻，会引起全细胞电压钳记录的点钳制问题，这可通过Rs Comp回路来消除。电极入液之后会产生所谓的“快电容”Cp，即内外液相对于电极壁形成的杂散电容，在形成GΩ封接后变得更明显。而当吸破细胞膜形成全细胞模式后，还能观测到“慢电容”Cm，即对于细胞膜的充放电而产生的电容电流。可以通过电容补偿回路来消除这些电容尖峰的影响。由于阻容藕合电路中电阻和电容值的不同，快慢电容的幅度和时间常数都不同。对于有突起的细胞如脑片中的神经元，还存在空间钳制问题，这就难以从电路上消除它的不利影响。

全细胞膜片钳模式下有电压钳记录和电流钳记录两种。电压钳记录的原理与电压钳技术相似，但有所不同：首先，全细胞电压钳记录只使用单根电极，但在电学效果上同时实现了电压钳制和电流记录。其次，电压钳记录的电极不插进细胞，对细胞造成的损伤较小，因而能用于小细胞如神经元的研究。电流钳记录则是通过钳制电极电流来测量膜电位。电流钳在本质上也是电压钳位，它将差分放大器的输出电流与指令电流相比较，然后将这个差动输出施加到放大器前级的倒相端，通过高速反馈使得同相端的电压与其相等，无论电极电流是否为零，都能从输出电压得到膜电位的准确数值。

根据细胞膜的电路模型，全细胞模式还可用于监测膜电容的变化。当通过电极给细胞膜一个高频正弦波时，由于膜电容的存在，膜电阻的反应会有一个明显的相位滞后，这个时间延迟由膜电容、膜电阻和电极电阻三者决定。当后面两个因素固定时，膜电容的变化就会引起膜电阻反应与输入之间的相位差的变化。对于各种分泌细胞：胰岛细胞、肾上腺分泌细胞或神经分泌细胞，细胞的分泌伴随着膜表面积也就是膜电容的变化，可以通过监测相位差的变化来观测细胞的分泌过程。

单通道记录的关键在于降低背景噪声。电阻反馈式放大器存在两个问题：一是反馈电阻本身的热噪声；另一个是反馈电阻本身的杂散电容。对于前者，当采用大电阻值反馈电阻时，就能将热噪声降低到可以接受的范围。但反馈电阻的杂散电容与电阻形成一个低通滤波器，按照现在的工业标准（50G，0.1pF），这个滤波器会使采集到的单通道信号严重失真。对于这个问题，可以采用一个高频提升器（high frequency boost），信号经过这样的处理就会引入高频噪声，因此必须经过低通模拟滤波。

1976年在封接电阻只有10—20MΩ的情况下，记录了蛙去神经支配的肌纤维膜乙酰胆碱受体的单通道电流，由于背景噪声的影响，单通道电流矩形脉冲的形状很不明显。若要记录单个离子通道的微弱电流，就必须将噪声降低到极小，但按照‘Johnson’公式，由带电粒子的热运动所引起的电流噪声为：Irms = (4kTfc/R)1/2，因此就必须极大地提高电阻。因为放大器输入阻抗、膜片电阻和反馈电阻都很高，所以必须极大地提高封接电阻。

后来发现当略施负压之后封接电阻很快上升到了GΩ的范围，背景噪声急剧下降，使得高分辨率的单通道记录变为可能。随后Hamill和Horn等人将小块膜片从细胞膜上分离下来而不影响封接，这样就形成了单通道记录的三种模式：细胞贴附式、内面向外式、外面向外式，连同全细胞模式于是便有了膜片钳的四种经典记录模式。Hamill等人在1981年发表的奠基性论文标志着膜片钳技术的成熟，随后在全世界各个生理学、神经生物学和生物物理学实验室得到了广泛的应用，极大地推动了离子通道和相关学科的研究。