新分子生物学课件2012-5

• 3、用于DNA序列分析 主要依靠短的标记寡核苷酸片段探针与靶DNA 杂交，利用杂交所获得的图谱分析靶DNA序列。 • 4、用于基因诊断和基因药物设计 • DNA芯片可用于大规模的筛查由基因突变所引 起的疾病。作出正确的诊断后，就可针对病变 的靶序列设计基因药物，以改变靶序列的表达 情况而达到治疗该疾病的目的。 • 目前已有几种DNA芯片实现了商品化。
（七）巢式PCR（N-PCR）
• 设计两对引物：外引物对和内引物对。外引物的 互补序列在模板的外侧，因此，外引物结合于模 板的外侧，而内引物的互补序列在模板的内侧， 所以，内引物结合于模板的内侧（见图）。该方 法能提高检测灵敏度和特异性
（八）不对称PCR（asymmetric PCR）
• 不对称PCR是一端使用高浓度引物，另一端使 用低浓度引物，用以扩增单链DNA的方法。 • 目的： • 扩增产生单链DNA。 • 原理： • 反应中采用两种不同浓度（1：50）的引物 进行不对称扩增。其原理见图9-10
• （3）PCR扩增及其监测 • 荧光PCR独特之处是：在PCR过程中，能利用荧 光染料释放的荧光信号变化直接反映PCR扩增产 物数量的变化。由于荧光信号变量与扩增产物变 量成正比，通过自动化仪器对荧光进行采集和分 析，能够实现对PCR过程的实时监测，达到对原 始模板定量分析的目的。 • 主要采用以下几种模式： • ①仿溴乙锭着色检测, • ②荧光标记引物 , • ③荧光标记探针 : • PCR体系中除常规扩增引物外，还需要针对扩增 模板的特异性探针，探针结合的位置在引物对的 中间。
（六）原位PCR(in-situ PCR)
• 原位PCR——直接用细胞涂片或石蜡包埋组织 切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异 探针进行原位杂交检测含相应特异序列的细胞 的一种方法。 其关键步骤是制备细胞： • ①细胞固定：通常用1%～4%的聚甲醛固定细 胞， • ②蛋白酶K彻底消化蛋白质 。
（十）长片段PCR（long distance PCR）
• 用PCR技术扩增很长的DNA序列（超过5 kb的长 片段）时，可用2种DNA聚合酶进行扩增，第一 种DNA聚合酶含量多，无3′→5′外切酶活性，第 二种酶含量少，有3′→5′外切酶活性。在PCR扩 增过程中，当第一种酶掺入一个错误dNTP，这 时，第二个酶则切除错误碱基，使DNA合成继续 下去。 • 还可通过增加延伸时间，如10-20分钟，来合成 长DNA片段。 • 也可以应用续段PCR技术来扩增长DNA片段。
2、体外构建RNA-CRS
• （1）参考标准构建 • 为了对目的mRNA进行精确定量，人们在体外 构建了多种RNA-CRS。这些人为的RNA-CRS 与目的mRNA在序列、大小和二级结构上相同 或高度相似，可对目的mRNA进行精确定量分 析。 • 以重组人SCF（stem cell factor）为例，构建 RNA竞争性参考标准（图7-14）。
• （2）应用： ①将这些表达量恒定的mRN稀释成不同浓度， 分别与样本中的目的mRNA混合后，在各自不 同的引物引导下共同逆转录，共同进行PCR扩 增。 • ② 将待测模板的扩增产物与内标准的扩增产 物比较，当两者产物量相等时，待测mRNA量 即与内标准mRNA相应的稀释浓度相同，从而 达到定量的目的。 • 由于引物不同和mRNA的序列差异，扩增效率 有一定差异，经过成百万倍放大以后差异就更 大了，因此选择这类mRNA作为内标时，只能 对目的mRNA进行相对定量分析。
（十一）多重PCR(multiple PCR)
• 多重PCR——在一次反应中加入多种引 物，同时扩增一份DNA样品中的不同 DNA序列。 • 使用该方法的前提是，各对引物扩增的 DNA片段长度要有差别，否则不能用电 泳区分。
第四节 基因芯片和微阵列技术
• 基因芯片——在固相支持物上原位合成寡核苷酸 或者直接将大量DNA探针以点涂的方式有序地固 化于支持物表面，通过与标记的样品杂交和杂交 信号检测分析，以得到大量样品（30 000到60 000个基因）信号的DNA检测装置，又称为生物 集成芯片，DNA芯片，DNA微阵列，寡核苷酸 微芯片。 • 它的突出特点在于高度并行性，多样性，微型化 和自动化。它一出现，就显示出强大的生命力， 其发展速度令人瞩目，应用前景令人鼓舞。
5. 信号分析与解读
• 芯片杂交图谱的多态性处理与存储都由专门设计 的软件来完成。一个完整的生物芯片配套软件应 包括生物芯片扫描仪的硬件控制软件、生物芯片 的图像处理软件、数据提取或统计分析软件。 • 对所读取的数据的处理，目前已经有许多数学统 计的方法用于芯片数据处理与信息提取，应用最 广泛的是聚类分析（cluster analysis），此外还有 主成分分析(principal component analysis)、时间 系列分析(time series analysis)等，但是还没有一 种“标准”的统计方法。
• 再通过闪光将这些暴露出来的探针纤丝上的光 敏覆盖物去除，然后将芯片浸入含有A碱基的 溶液中，需要A碱基的探针纤丝上就增加一个 A碱基。 • ②将添加了A碱基的探针马上用光敏物质重新 覆盖起来，同时根据碱基需要（如C）更换新 的屏蔽掩模。这个屏蔽掩模将不需要C碱基的 探针钎丝遮掩起来，让需要C碱基的探针纤丝 暴露出来。
（四）反向PCR（inverse PCR）
• 反向PCR——对已知DNA片段两侧的未 知序列进行扩增和研究的一种简捷方法。 原理：见图7-17。
（五）Alu-PCR
• Alu序列是哺乳动物基因组中特有的重复序列， 拷贝数高达90万，散布于基因组DNA中。 • 利用Alu序列中高度保守的序列设计引物，扩增 两个Alu序列之间的未知DNA序列的方法—— Alu-PCR。见图7-18。
图7-13 RT-PCR原理和过程示意图
（二）定量RT-PCR
• ——通过设立RNA竞争性参考标准和利用PCR技 术来定量分析基因表达的一种最快速、敏感的方 法。 • 它与RT-PCR的区别：设立了RNA竞争性参考标 准（RNA-CRS）。 • 1、内源性基因模板标准的选择与应用。 （1）选择 • 选择那些在组织中普遍表达，且表达量比较恒 定的一类mRNA作为内源性基因模板标准。编码 这些mRNA的基因都是一些保守性强的管家基因， 如β-肌动蛋白等基因。
（九）固相锚定PCR（solid-anchored PCR） • 固相锚定PCR——利用固相基质上的特异性寡核 苷酸链作为引物合成cDNA，使合成的cDNA与 固相基质以共价键相连。 如用寡聚dT为引物合成的附着于CR模 板，将固相基质放入PCR反应混合液中即可扩增 cDNA 。用途很广。
4、杂交信号检测
• 常采用荧光法，其重复性较好，但灵敏度仍较 低，目前正在研发质谱法、化学发光法、光导 纤维法等， • 以荧光法为例：采用的检测手段是激光共聚焦 显微扫描技术，该技术可对高密度探针阵列每 个位点的荧光强度进行定量分析，因为样品与 探针错配一个或两个碱基，荧光强度将降低535倍，但该方法的不足之处是会产生假阳性结 果，见图7-20。
三、DNA芯片技术的主要应用
• 1、用于分析基因组和发现新基因 DNA芯片技术用于基因组研究可创造第三代遗 传图。 • DNA芯片技术可检测高密度DNA、样品用量极 少、自动化程度高而便于大量筛选新基因。 • 2、用于基因表达研究 DNA芯片技术可直接检测mRNA的种类及丰度， 是研究基因表达的有力工具。 •
• ⑦选择指数扩增期进行QRT-PCR（20次）； ⑧分析PCR结果： a、测定靶基因荧光信号和内标准荧光信号强度； 以lg（校正内标准荧光信号/靶基因荧光信号）为 纵坐标，[其中校正内标准荧光信号=（靶基因长 度/内标准长度）×内标准荧光信号] 以lg[RNA-CRS]拷贝数为横坐标（浓度） b、建立直线回归方程。 c、绘制回归直线：回归直线与横轴的交点表示 内标准和靶基因分子数之比为1∶1。 即, 最初的靶基因分子数等于内标准分子数。
• （2）应用 • 用SCF RNA-CRS对人重组SCF（干细胞因子）进 行了定量TR-PCR分析。 ①将SCF RNA-CRS稀释成不同浓度； ②分别与等量待测总RNA混合； ③在相同条件下，用相同引物进行逆转录，形成 cDNA； • ④用PCR技术对cDNA进行共同扩增（用荧光定 量PCR仪和被荧光素标记的dNTP） • ⑤用软件分析DNA片段的荧光信号强度/每次扩 增。 ⑥绘制PCR动力学曲线，确定达到平台期的循环 次数（假如为22次达到平台期）
（三）实时荧光定量RT-PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR）
• 1．原理 • （1）荧光染料（fluorescent dye, fluorochrome） • 荧光基团通常有自己的单一光吸收峰，即能吸收某一 特殊波长的光。荧光基团吸收激发光的能量后通常以 三种方式释放出能量： ①光能； ②热能； • ③转移给邻近的分子。 • （2）荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET） • 当某个荧光基团的发射光谱与另一荧光基团的吸收光 谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从 短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量） 的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移。相当 于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽（淬灭）。
A. 水解探针模式（hydrolysis probe）
• 采用双荧光标记探针（TaqmanTM 5-nuclease assay），利用Taq DNA聚合酶的5ˊ→3ˊ聚合酶 活性及5ˊ→3ˊ外切酶活性，在链的延伸过程中 实现链替换，并将被替换的探针切断， 使5′端标 记的TAMRA（荧光报告基团）和3′端标记的 FAM（荧光淬灭基团）分开，产生红色荧光。由 于荧光信号变量与扩增产物变量成正比，可根据 PCR反应液连续变化的的荧光强度，绘制反应曲 线，计算出初始模板数量。（图7-15）。
• 然后，将芯片浸入含有C碱基的溶液中，需要C 碱基的探针纤丝上就增加一个C碱基。 • 同样的程序也适用于T和G。 • 四个程序分别循环一次，所有探针纤丝都添加 了一个自己需要的碱基。四个程序依次循环20 次，就可以合成一个具有20个碱基的探针（目 前的标准长度）。 • 优点可以合成密度极高的阵列；缺点是耗时、 操作复杂。