华中农业大学植物过氧化物酶同工酶测定
华中农业大学《生物化学实验》试卷
华中农业大学本科生课程考试试卷考试课程与试卷类型：植物生理学实验原理与技术（A）姓名：学年学期：2008－2009－1 学号：考试时间：2009－－班级：一、名词解释 ( 每题 4 分 , 共 12分 )1. 聚丙烯酰胺凝胶2. 离心技术3．可见光分光光度法/反相纸层析二、填空题 ( 每空 2 分 , 共 42分 )1. 反相纸层析法分离油菜不饱和脂肪酸的实验中 ,分离后的不饱和脂肪酸经红氨酸溶液显色后 , 其最终产物颜色是（1）,从点样端起层析谱带所对应的脂肪酸依次是 (2) 、（3）、（4）、（5）、（6）。
2. 圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶的实验中 , 电泳时上槽接电源（7）极 ,下槽接电源 (8) 极 , 电泳开始电流应调节至每管（9）mA, 十分钟后电流调节至每管 (10) mA; 在上槽或样品中加入溴酚蓝是起（11）的作用。
3. 核酸提取过程中 , 将含有 DNA 的溶液置72℃处理 3 分钟，其目的是（12）；在淀粉酶活性测定过程中将淀粉酶液置于 70℃下处理 15 分钟的目的是（13）。
4．在微量凯氏定氮法测定植物组织中的总氮和蛋白氮，有三个主要的实验阶段，它们分别是（14）、（15）和（16）。
在第二阶段，若收集三角瓶中的溶液颜色由_（17）变为（18），表明反应完全。
第三阶段所用的标准浓度的滴定溶液名称是（19）。
5. DNA 提取研磨时加入的研磨缓冲液的NaCl浓度是（20），研磨时加入SDS的作用是（21）三、是非判断题 (判断对错，对的标T，错的标F，每题 2 分，共 10 分 )1．萌发的小麦种子中含有很高活性的淀粉酶，其中α－淀粉酶不耐热，在70℃迅速钝化。
（）2．本学期测定还原性糖和可溶性蛋白含量时都用到了斐林试剂，这两个实验中所用的斐林试剂的配方是相同的。
（）3．DNA提取中，加入冷乙醇是为了使DNA分子复性变粗。
（）4．离心机使用中，要求同一台离心机所用的离心管都有相同的重量。
植物过氧化物酶同工酶的研究进展
植物过氧化物酶同工酶的研究进展作者：顾雯雯胡亚婷韩英卞涵佳罗兵孙海燕万能杨志刚沈宗根来源：《安徽农业科学》2014年第34期摘要过氧化物酶（Peroxidase，POD）是植物体内广泛存在的氧化还原酶，在植物体内具有多种同工酶。
POD同工酶具有种属、器官以及发育阶段特异性。
它作为遗传标记广泛应用于植物的品种鉴定、遗传多样性分析、植物抗病性分析等方面。
该研究综述了植物POD同工酶检测技术的研究进展以及POD同工酶的应用，提出进一步研究植物POD同工酶的建议。
关键词植物;过氧化物酶同工酶;研究进展中图分类号 S188 ;文献标识码 A ;文章编号 0517-6611（2014）34-12011-03Research Progress of Peroxidase Isozymes in PlantsGU Wenwen1， HU Yating2， HAN Ying3， LUO Bing1* et al（1. College of Biology and Food Engineering， Changshu Institute of Technology，Changshu， Jiangsu 215500; 2. Suzhou Wuyuetian Organic Agriculture Science and Technology Co. Ltd.， Wujiang， Jiangsu 215216; 3. Wujiang Pingwang Battle Companion Grape Professional Cooperatives， Wujiang， Jiangsu 215221）Abstract The peroxidase （POD）， existed widely in plants， was an oxidoreductase and had various isozymes. The peroxidase isozymes had specificity in species， organs and developmental stage. As a genetic mark， the peroxidase isozymes were widely used in varieties identification，genetic diversity analysis， disease resistance. This paper reviewed the advances of detecting method for analysis of peroxidase isoenzymes in plants and the application of peroxidase isozymes. Suggestions were put forward for the further research of peroxidase isozymes in plants.Key words Plants; Peroxidase isozymes; Research progress基金项目江苏省青年基金项目（BK20140417）;苏州市科技计划项目（SZS201102，SYN201110，SNG201323和SNG201242）;江苏省大学生实践创新训练计划项目（201310333032Y）;苏州市吴江区科技计划项目（WN201311，WN201317）;常熟市科技计划项目（CS201205）。
植物过氧化物酶实验报告
一、实验目的1. 了解过氧化物酶在植物生理过程中的作用。
2. 掌握愈创木酚法测定过氧化物酶活性的原理和方法。
3. 通过实验，提高学生运用实验方法分析植物生理问题的能力。
二、实验原理过氧化物酶（POD）是一种广泛存在于植物体内的酶，催化H2O2分解产生O2和H2O。
愈创木酚法是一种测定POD活性的常用方法，其原理是POD催化H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，该产物在470 nm处有最大光吸收值。
通过测定该波长下的吸光度变化，可以计算出POD的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：马铃薯块茎2. 仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管3. 试剂：100 mmol/L的磷酸缓冲液（pH 6.0）、愈创木酚溶液、30% H2O2、20 mmol/L KH2PO4四、实验步骤1. 制备酶提取液：取马铃薯块茎约0.5 g，加入5 mL磷酸缓冲液（pH 6.0），研磨均匀，过滤，收集滤液，4℃下保存备用。
2. 测定酶活性：a. 设置酶活性测定体系：取2 mL酶提取液，加入1 mL 30% H2O2和1 mL愈创木酚溶液，混匀，立即放入分光光度计中，于470 nm处测定吸光度。
b. 设置对照体系：取2 mL酶提取液，加入1 mL磷酸缓冲液（pH 6.0）和1 mL愈创木酚溶液，混匀，立即放入分光光度计中，于470 nm处测定吸光度。
3. 计算酶活性：a. 酶活性 = [(A1 - A2) / (t2 - t1)] × 0.01 × (1.977 - 0.874) / 10 × 0.01 × 250.027575b. 其中，A1为酶活性测定体系的吸光度，A2为对照体系的吸光度，t1为酶活性测定体系测定时间，t2为对照体系测定时间。
五、实验结果与分析1. 实验结果：通过实验，得到马铃薯块茎中POD的活性为0.027575 U/g。
2. 结果分析：a. 从实验结果可以看出，马铃薯块茎中含有一定量的POD，且活性较高。
实验9-10 植物过氧化物酶同工酶的测定(凝胶圆盘电泳)
（五）记录并计算： 记录并计算： 观察、记录酶谱， 观察、记录酶谱，并 计算各同工酶的相对 迁移率。 迁移率。
【要点提示】 要点提示】
1. 分离胶聚合时间应控制在 ～60min，聚合过 分离胶聚合时间应控制在30～ ， 快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或 快使凝胶太脆易断裂，主要是 或TEMED过 过 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是 或 TEMED用量不足或已失效。 用量不足或已失效。 用量不足或已失效 2. 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水， 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 凝胶底部断裂等，应注意调整。 凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/ 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过 管。
（四）染色： 染色： 临用时配制染色液：（ ml ） 临用时配制染色液：（10 ：（ 联苯胺母液 H2O 3% H2O2 0.5 ml 9.3 ml 0.2 ml
将染液倒入盛有凝胶条的试管中（ 将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过 胶条）。约10min后用自来水冲洗。 胶条）。约 后用自来水冲洗。 ）。 后用自来水冲洗
【实验步骤】 实验步骤】
（一）过氧化物酶的提取：取8~12粒发芽 过氧化物酶的提取： 粒发芽 的麦粒，加入1ml H2O 或0.5mol/L Tris的麦粒，加入 HCl缓冲液（pH 6.8），冰浴上研成匀浆。 缓冲液（ ），冰浴上研成匀浆。 缓冲液 ），冰浴上研成匀浆 转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵 转入离心管，再用 上述溶液冲洗研钵 壁并全部转入离心管，4000r/min离心 壁并全部转入离心管， 离心10 离心 min，上清液供电泳分析用。 ，上清液供电泳分析用。
华中农业大学植物过氧化物酶同工酶测定-ct-PPT课件
2
二、材料、设备与试剂
（一 ）实验材料 ：小麦芽。 （二）设备 ：1.冷冻离心机；2.稳流稳压电泳 仪；3. 电泳槽（园盘型）等。 （三）试剂
1.分离胶缓冲液
2.分离胶贮液：
3.过硫酸铵：现配现用。
Designed by XK Wang
3
4.四甲基乙二胺(TEMED)。
5.电极缓冲液：Tris6.0g，Gly（甘氨酸） 28.8g，用水定容至1000mL(pH8.3)，用前稀释 10倍。
同工酶具有不同的迁移速将电泳后的凝胶置于含有将电泳后的凝胶置于含有h2o2h2o2及联苯胺及联苯胺的溶液中染色利用过氧化物酶催化的溶液中染色利用过氧化物酶催化hh22o2o2分分解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物理出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置多条有色带酶同工酶在凝胶中存在的位置多条有色带即构成过氧化物酶同工酶酶谱
H2O2，混匀后倒入盛有凝胶条的培养皿。此时可以看 到胶条上出现蓝色或棕褐色环，即过氧化物酶酶带，约
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10min后用自来水冲洗，此时蓝色带会慢慢变为棕褐色 条带。
湿地松感染松色二孢菌后过氧化物酶同工酶的测定
湿地松感染松色二孢菌后过氧化物酶同工酶的测定
边银丙;周茂繁
【期刊名称】《华中农业大学学报》
【年(卷),期】1996(15)3
【摘要】聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果表明，湿地松健康嫩茎组织过氧化物酶同工酶酶谱中有４条酶带，刺伤组织较健康组织新增加３条酶带。
分别用松色二孢菌华中型（ＨＺ型）代表菌株ＪＨ－１和华南型（ＨＮ型）代表菌株ＢＹ－２接种被刺伤的湿地松嫩茎，接种弱致病力的菌株ＢＹ－２后，感病组织的过氧化物酶同工酶酶谱中比刺伤对照新增加１条酶带；接种强致病力的菌株ＪＨ－１后，感病组织的过氧化物酶同工酶酶谱中较刺伤对照新增加３条酶带。
２个供试菌株在侵染寄主后导致寄主的过氧化物酶同工酶酶谱上出现差异的表现，与它们在形态特征、产孢条件和致病力等方面存在显著差异的表现相同。
【总页数】4页(P225-228)
【关键词】湿地松;松色二孢菌;过氧化物酶同工酶;致病力
【作者】边银丙;周茂繁
【作者单位】华中农业大学植保系
【正文语种】中文
【中图分类】S763.712.4;S763.150.1
【相关文献】
1.湿地松色二孢菌和可可球二孢菌根腐病研究 [J], 钟小平;梁子超
2.国外松枯梢病的松色二孢菌9个菌株生物学特性的研究 [J], 彭星元;苏开君
3.松色二抱菌7个菌株酯酶同工酶的比较研究 [J], 边银丙;周茂繁
4.松色二孢菌酯酶同工酶特性的研究 [J], 边银丙;周茂繁
5.7个松色二孢菌菌株生物学特性的研究 [J], 边银丙;周茂繁
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过氧化物酶同工酶含量测定
实验材料与器材
（一）材料 菠菜叶片（或苜蓿种子）
（二）仪器设备 722分光光度计 烧杯 量筒 移液管 具塞刻度试管
实验试剂
1．标准蛋白溶液：100μg/ ml牛血清白蛋白：称取牛血清白 蛋白25 mg，定容到100ml，取40ml该溶 液定溶到100ml。
2．考马斯亮蓝G-250：称取50 mg考马斯亮蓝G-250，溶于 25ml 95%的乙醇中，加50ml 85%的 磷酸定容到500ml，贮存于棕色试剂 瓶中，常温下可以保存一个月。
实验步骤
（一）标准曲线的绘制 取6支具塞刻度试管，按下表依次加入标准蛋白，向
各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，摇匀，放置5min 左右，用1cm的比色皿在595nm处测定吸光值，以蛋白的 浓度作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
表 绘制标准曲线各试剂加入量
管号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白质（ml）
考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blue G-250）与
蛋白质的结合十分迅速，2min左右即可达到平衡，其结合物 在室温下1小时内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干 扰物较少，是一种比较好的定量方法。其缺点是在蛋白质浓 度太高时线形偏低，且不同来源蛋白质与色素的结合状况有 一定差别。
实验原理 实验材料与器材 实验试剂coomassie brilliant blueG-250）测 定蛋白质酶含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态 下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区域结合后变 为青色，前者最大吸收值在465nm，后者在595nm。在一定 蛋白质浓度范围内（1～1000μg），蛋白质与色素结合后在 595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比，故可用于蛋白 质的定量测定。
过氧化物酶活性的测定实验报告
过氧化物酶活性的测定实验报告一、实验目的过氧化物酶（Peroxidase，POD）广泛存在于植物、动物和微生物中，与生物体内的多种生理过程密切相关。
本次实验旨在掌握测定过氧化物酶活性的原理和方法，了解过氧化物酶在生物体内的作用和意义。
二、实验原理过氧化物酶能催化过氧化氢氧化酚类或胺类化合物，生成有色产物。
本实验采用愈创木酚作为氢供体，在过氧化物酶的催化下，愈创木酚被氧化生成茶褐色产物。
通过测定反应体系在470nm 处的吸光度变化，可以计算出过氧化物酶的活性。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的植物叶片（如菠菜叶）2、实验试剂（1）005mol/L 磷酸缓冲液（pH 55）（2）005mol/L 愈创木酚溶液（3）2% H₂O₂溶液（4）10% 三氯乙酸溶液3、实验仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）恒温水浴锅（4）研钵（5）移液器（6）容量瓶（7）试管四、实验步骤1、酶液提取称取 05g 新鲜植物叶片，剪碎后放入研钵中，加入 5mL 005mol/L 磷酸缓冲液（pH 55），研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，在 4℃下以 10000r/min 离心 15min，上清液即为酶提取液。
2、反应体系配制取 4 支试管，按下表加入试剂：｜试管编号｜ 005mol/L 磷酸缓冲液（mL）｜ 005mol/L 愈创木酚溶液（mL）｜ 2% H₂O₂溶液（mL）｜酶提取液（mL）｜｜｜｜｜｜｜｜ 1（对照管）｜ 29 ｜ 10 ｜ 01 ｜ 0 ｜｜ 2（测定管）｜ 27 ｜ 10 ｜ 01 ｜ 02 ｜3、反应与测定将对照管和测定管置于 37℃恒温水浴锅中预热 5min，然后向测定管中加入 02mL 酶提取液，迅速摇匀，立即开始计时。
在反应 3min 后，立即向两支试管中加入 1mL 10% 三氯乙酸溶液终止反应。
以对照管为空白，在 470nm 处测定测定管的吸光度值（A₄₇₀）。
4、计算过氧化物酶活性过氧化物酶活性（U/g·min）＝（A₄₇₀×Vₜ）／（W×Vₜ×t）其中，A₄₇₀为测定管的吸光度值；Vₜ 为反应液总体积（mL）；W 为样品鲜重（g）；Vₜ 为测定时取用的酶液体积（mL）；t 为反应时间（min）。
实验五过氧化物酶酶活性的测定
试剂
对照管
测定管
0
1
2
3
0.01mol/L磷酸缓冲液，ml
2.92
2.9
2.9
2.9
0.02mol/L 愈创木酚，ml
0.05
0.05
0.05
0.05
酶液，ml
0
0.02
0.02
0.02
加好反应物，摇匀，立即加新配制的H2O2 (0.01 ml)，即刻摇匀并计时，每隔 30s 读数1次，共计6个数值。
三、实验材料
菠菜、油 菜、树叶、 草、
四、仪器用品与试剂
分光光度计，研钵，移液管，吸管 愈创木酚，30％过氧化氢，磷酸缓冲液
五、实验步骤
1、称取植物材料 0.5g ，剪碎，放入研钵中，加入 1 ml 磷酸缓冲液（ 0.05mol/L）研磨 成匀浆，以 12000 rpm 离心 15 min ，上清液即为粗酶液。
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过
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氧
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化
意 赅
物
的
阐 述
酶
Байду номын сангаас
您 的 观
活
点 。
性
一、实验目的
熟悉测定过氧化物酶活性的常用方法及其测 定原理。
01 过氧化物酶（POD)
02
过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都 有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较 弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度。
枇杷属植物过氧化物酶同工酶研究
枇杷属植物过氧化物酶同工酶研究
方德秋;章恢志
【期刊名称】《华中农业大学学报》
【年(卷),期】1989(8)2
【摘要】利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,分析枇杷属7个种的皮层、根以及普通枇杷14个品种的幼果果肉的过氧化物酶(POX)同工酶;比较果实在不同生长期的POX同工酶差异。
结果表明:种间皮层、根POX同工酶酶谱差开明显,而种内极小;春季开花与秋冬开花的种酶谱差异很大;14个品种的果肉共表现3种主要酶谱型;红沙类与白沙类品种的酶谱无差异;枇杷果实在谢花后20天至果实迅速膨大前,酶谱清晰稳定;根提取液和新鲜根在低温下贮藏,酶谱均无变化。
【总页数】7页(P144-150)
【关键词】枇杷属植物;过氧化物酶;同功酶
【作者】方德秋;章恢志
【作者单位】华中农业大学园艺系
【正文语种】中文
【中图分类】S667.3
【相关文献】
1.毛茛属两种植物的过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶的研究 [J], 徐根娣;刘鹏;钱丽
2.黄杨属几种植物的过氧化物酶和酯酶同工酶研究 [J], 王玲玲;徐娜;李俊雁;关旸
3.荞麦属植物三叶期幼叶过氧化物酶同工酶研究 [J], 张以忠;陈庆富
4.阴山荠属和泡果荠属植物染色体数目及过氧化物酶同工酶的比较 [J], 张渝华
5.阴山荠属和泡果荠属植物染色体数目和过氧化物酶同工酶研究 [J], 张渝华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物体内过氧化物酶活性的测定
植物体内过氧化物酶活性的测定一、目的过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控 IAA 水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的 H2O2的毒害作用。
故在科研上常加以测定。
二、原理在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色 4 －邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（ A ）值，即可求出该酶活性。
三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。
3. 试剂及配制：0.1mol·L－1磷酸缓冲液（ pH7 ）。
反应液（100ml 0.1mol · L－1磷酸缓冲液（ pH6 ）中加入 0.5ml 愈创木酚、 1ml 30 ﹪ H 2 O 2，充分摇匀）。
四、实验步骤1. 酶液提取称取植物叶片 1g ，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为 10mlpH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在 8000 r / min 离心 15min ，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。
2. 酶活性测定吸取反应液 3ml 于试管中，加入酶提取液 0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径 1cm 的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在 470nm 波长处，以时间扫描方式，测定 3min 内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△ A 470 ）。
五、酶活性计算按下式计算酶的相对活性△ A 470 ×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1） = ————————————————————样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）。
华中农业大学《生物化学实验》试卷
华中农业大学《生物化学实验》试卷华中农业高校本科生课程考试试卷考试课程与试卷类型：植物生理学试验原理与技术（A）姓名：学年学期：2022－2022－1 学号：考试时光：2022－－班级：一、名词解释( 每题4 分, 共12分)1. 聚丙烯酰胺凝胶2. 离心技术3．可见光分光光度法/反相纸层析二、填空题( 每空2 分, 共42分)1. 反相纸层析法分别油菜不饱和脂肪酸的试验中,分别后的不饱和脂肪酸经红氨酸溶液显色后, 其终于产物色彩是（1）,从点样端起层析谱带所对应的脂肪酸依次是(2) 、（3）、（4）、（5）、（6）。
2. 圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳分别过氧化物酶同工酶的试验中, 电泳时上槽接电源（7）极,下槽接电源(8) 极, 电泳开头电流应调整至每管（9）mA, 非常钟后电流调整至每管(10) mA; 在上槽或样品中加入溴酚蓝是起（11）的作用。
3. 核酸提取过程中, 将含有DNA 的溶液置72℃处理3 分钟，其目的是（12）；在淀粉酶活性测定过程中将淀粉酶液置于70℃下处理15 分钟的目的是（13）。
4．在微量凯氏定氮法测定植物组织中的总氮和蛋白氮，有三个主要的试验阶段，它们分离是（14）、（15）和（16）。
在其次阶段，若收集三角瓶中的溶液色彩由_（17）变为（18），表明反应彻低。
第三阶段所用的标准浓度的滴定溶液名称是（19）。
5. DNA 提取研磨时加入的研磨缓冲液的NaCl浓度是（20），研磨时加入SDS的作用是（21）三、是非推断题(推断对错，对的标T，错的标F，每题2 分，共10 分)1．萌发的小麦种子中含有很高活性的淀粉酶，其中α－淀粉酶不耐热，在70℃快速钝化。
（）2．本学期测定还原性糖和可溶性蛋白含量时都用到了斐林试剂，这两个试验中所用的斐林试剂的配方是相同的。
（）3．DNA提取中，加入冷乙醇是为了使DNA分子复性变粗。
（）4．离心机使用中，要求同一台离心机所用的离心管都有相同的分量。
实验十一 植物体内过氧化物酶活性的测定
活力单位(U) w(g FW)
W=W总（g FW)* V(mL)/V总
实验十一 植物体内过氧化物酶 活性的测定
——愈创木酚比色法
一、原理
过氧化物酶 过氧化物酶[perox idase, POD] 广泛 存在于各种动物、植物和微生物体内。 催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧 化反应: RH2+ H2O2→2H2O + R
•2 POD 分子结构特点
POD 是一种由单一肽链与卟啉构成的血 红素蛋白, 脱辅基蛋白分子须与血红素结 合才构成全酶。
3mL反应液+0.2mL粗酶液，震荡混匀后 立刻记时，以3mL反应液+ 0.2mL磷酸缓 冲液调零，测OD470，30’’内读第一次数， 之后每10S读数一次，至OD值>1.000。
3、计算酶活性
选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式 计算； 以每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活 力单位（U）。
3、POD的主要生理功能
参与活性氧代谢过程； 参与木质素和木栓质的合成； 参与生长素的降解。
注：除了与植物正常代谢和生长发育相关 的结构型POD 外, 很大部分POD的合成属于诱 导表达型。
二、实验材料与试剂
实验材料： 不同浓度Cd处理7d的菱叶片； 试剂 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0） 愈创木酚； H2O2。
三、实验步骤
1. 提取酶液：
叶片2片（w gFW）+pH7.0磷酸缓冲液5mL 研磨，离心（4000rpm*10min），上清液 即为粗酶液。
2、配制反应液
1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 50ml +28uL愈创木酚+19uLH2O2(30%)
植物组织中过氧化物酶活性的测定
实验四植物组织中过氧化物酶活性的测定一、实验目的：1、学习测定植物组织中过氧化物酶活性的方法。
二、实验原理：过氧化物酶（POD）广泛存在于植物体中，该酶催化H2O2氧化，以清除H2O2对细胞生物功能分子的破坏作用。
在有H2O2存在的条件下，过氧化物酶使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测定470nm处茶褐色物质的生成量以检测POD活性。
三、实验仪器及材料：1、仪器：研钵、剪刀、天平、量筒、试管、分光光度计、移液管、比色皿、离心机、秒表2、材料与试剂：苹果、经逆境处理的绿豆幼苗、反应混合液、20mmol/LKH2PO4四、实验步骤：1、POD的提取分别称取绿豆幼苗、苹果果肉各2g,分别加入预冷的10ml 20mmol/LKH2PO4，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心10min，收集上清液，待用。
2、POD活性的测定取分光光度计比色杯2只，在其中一只加入3ml反应混合液和1ml KH2PO4作为对照；另一只加入3ml反应混合液，1ml苹果上清液，立即开启秒表计时，测定470nm处OD值，每隔30s读数一次。
取1ml绿豆幼苗上清液重复上述操作。
五、实验结果：1、在酶液中加入3ml反应混合液后，苹果酶液立即呈茶褐色，而绿豆幼苗酶液的茶褐色深至黑褐色。
2、苹果酶液以及绿豆幼苗酶液在470nm处OD值如下：苹果酶液OD值与时间的关系曲线图以每分钟光密度（OD470nm）变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，即：苹果POD活性=[ΔOD470/(0.01×wt)] ×D=[（0.28－0.249）/（0.01×3×2）] ×D=0.52D（此值忽略稀释倍数）其中w为样品鲜重，t为反应时间，D为稀释倍数绿豆幼苗酶液OD值与时间的关系曲线图绿豆幼苗POD活性=[ΔOD470/(0.01×wt)] ×D=[（0.940－1.56）/（0.01×3·2）] ×D =6.3 D（此值忽略与苹果酶液相同的稀释倍数）由于绿豆幼苗酶液浓度较大，测OD值前稀释了两倍，所以绿豆幼苗酶液POD 活性为12.67D六、结果分析：1、由苹果酶液OD值与时间的关系曲线图中，OD值与时间的关系基本呈线性关系，故任取变化较均匀的一段数据均可计算出POD活性。
香椿过氧化物酶同工酶分析
３ ５ Ｃ％ ＝２ ． ％； 离胶 ： 。 ％， ００ 分 Ｔ％ ＝１ ． ％， ％ ＝ ００ Ｃ ４。 ％。电泳起始 电流 为 ５ Ｏ ｍＡ， 指 示 剂 进 入 分 离 待 胶后 ， 压至 ２ Ｏ 稳 流为 ４ ｒＡ， 稳 ５ ｖ， Ｏｎ 电泳 时 间为 ５ｈ ， 电泳 环境 为 ４ 。酯酶 同工 酶用 乙酸 一ａ ℃ 一萘脂 、 乙 酸 ～８ 一萘脂 和 固蓝 Ｒ Ｒ盐染 色 ； 氧化 物酶 同工 酶 过
带 区为香椿 种质 资 源特 征 区 ， ａ ｂ ｃ ｄ带 为香 椿 且 、 、、 种 质资 源的过 氧化物酶 同工酶 特征带 。
子 公 司 Ｂ， 为广西 Ｂ， 为郧西 Ｂ １ ８号 ９号 ，Ｏ号为华 中
农 业大学 ， １ 为 山东 Ｂ，２号 为 郧县 Ｂ ｌ号 １ 。各 采 样
单株均为 移植苗 木 ， 龄为 ３ ， 苗 年 生长 良好 。 １２ 方 法 。 １２ １ 取 样反 制样 。． ２０ ００年 ５月 份取 一年 生香 椿 树冠上部 当年 生枝条 上 生 长 旺盛 的幼 嫩 叶 片 ， 羽 用
得Ｌ 。 目前 ， 同工 酶 酶 谱是 鉴 定 品种 资 源 的 重要
采用联 苯胺方 法 染色 电泳 结 束后 ， 定 酶 带迁 移 测 距离 和指示 剂距 离 ， 计算 Ｒ 值 ｆ
２ 结 果分 析
２ 香椿 过氧化物 酶 同工酶酶 谱分析 １
标志之 一¨ ， 香椿 酶 谱 进行 分 析 ， 以 为 香 椿 品 Ｊ对 可 种分 类提供 依据 。
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湖 北农业 科学
ＨＵＢ Ａ ＲＩ ＵＬ ＵＲ ｌ Ｓ Ｉ ＮＣ Ｓ ＥＩ Ｇ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｅ Ｅ Ｎｏ １ ２ ０ ．０ ２
６ ３
香 椿 过 氧 化 物 酶 同 工 酶 分 析
综合性实验--过氧化物酶活性测定及同功酶电泳
3. POD的主要生理功能： ◆ 参与活性氧代谢过程； ◆ 参与木质素和木栓质的合成； ◆ 参与生长素的降解。
二、实验材料与试剂 1.材料：玉米幼苗
2.试剂： 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）；0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0） 愈创木酚； H2O2
三、实验步骤
1. 提取酶液：取样品1.0g，加入2ml的0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液，冰浴研 磨，10000rpm，4℃离心后取上清，即为粗酶液。 2. 酶活性测定：采用愈创木酚比色法测定，对照为煮沸5分钟的粗酶液，反应 体系包括：0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液2.9ml；0.05 mol/L愈创木酚1ml; 2%H202 1ml；粗酶液0.1 ml，反应1分钟后，立刻在470nm下，测定OD值。 以每分钟在470nm处吸光度的变化0.01为一个酶活单位。 3. 计算酶活性：选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式计算； 以每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活力单位（U）。
综合性实验
植物体内过氧化物酶活性测定及同工酶电泳
过氧化物酶活性测定
一、原理
1. 过氧化物酶[perox idase, POD] ： 广泛存在于各种动物、植物和微生物 体内。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应: RH2+ H2O2→2H2O + R 2. POD 分子结构特点：POD 是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白, 脱 辅基蛋白分子须与血红素结合才构成全酶。
二、材料、仪器设备及试剂
1.材料：玉米幼苗
2.仪器设备：稳流稳压电泳仪；冷冻离心机及离心管； pH试纸； 3.试剂： （1)分离胶缓冲液（pH8.9）：1mol/L HCl 48ml，Tris36.6g， TEMED0.23ml，加水定容 至100ml。 (2)分离胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加水溶解并定容至100ml，过滤 后使用。 (3)过硫酸铵溶液：过硫酸铵0.2g，加水定容至100ml制胶时现配现用）。 (4)浓缩胶缓冲液：1mol/L HCl48ml＋Tris5.98g＋TEMED0.46ml，调pH6.7，并定容至 100ml。 (5)浓缩胶贮备液：丙烯酰胺10g，甲叉双丙烯酰胺2.5g,加水定容到100ml，使用前过滤。 (6)电极缓冲液：Tris 6.0g，Gly 28.8g， 用水定容至1000ml（pH8.3），用前稀释10倍。 (7)四甲基乙二胺（TEMED）。 (8)0.1％的溴酚蓝水溶液。 (9)联苯胺染色母液：联苯胺1g＋冰醋酸18ml＋H2O2ml溶解贮于棕色瓶中。
实验三_植物叶片过氧化物同工酶的PAGE分析
光聚合：使用核黄素作催化剂，聚合反应需光照， 适用于制备
浓缩胶(大孔胶)。 应控制AP和TEMED的用量，使凝胶在40min-1hr之间聚合完全 为宜。
2.2.2 凝胶孔径的可调性及其有关性质
(1)凝胶性能与总浓度及交联度的关系： T%（Acr和Bis总浓度）= (a+b)/m× 100 C% (交联剂百分比) = b/(a+b) × 100 其中，a= Acr克数，b= Bis克数，m=缓冲液体积（ml） 欲制备完全透明而又有弹性的凝胶， 应控制a/b=30左右。 经验公式: C = 6.5 － 0.3 T
(5) Tris-Gly电极缓冲液 pH8.3
注意：Acr和Bis是对中枢神经系统有毒的试剂，操作时应避免直接接触和吸 入它的粉末。
(6)
40% 蔗糖溶液(W/V)。
(7) TEMED(浓度≥98%)
(8) 0.14% 过硫酸胺（AP）： 4℃贮存仅能用一周，最好当天配制。
(9) 0.1%溴酚蓝指示剂
这类酶存在于生物的同一属、种、变种，或同一个体的不同组织、 细胞中，因而，可以通过对它们的分析，并以其多态性作为遗传 标记，研究种质资源的亲缘关系、重要性状的同工酶表现等。例 如，人们用脂酶同工酶酶谱的特异性，鉴定了近缘野生莴苣 （Lactuca serrila）与莴苣栽培种（L. sativa）的亲缘关系，以及 南瓜属三个主要栽培种的亲缘关系。但是，同工酶在同一物种、 同一个体的不同生长发育时期，其表现是不一样的，有一些同工 酶的重现性较差，应用中也应当注意。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
(10) 联苯胺染色母液：联苯胺1g + 冰醋酸18ml + H2O 2ml溶解储于棕色
瓶中。 注意：（1）联苯胺的毒性很强，其固体和蒸气都能通过皮肤迅速进 入体内，引起恶心、呕吐，损害肝和肾脏。联苯胺及它的盐都是致癌 物质。 （2）联苯胺染色液要当天配制。
实验十二 药用植物过氧化物酶同工酶分析及活性比较
实验十二药用植物过氧化物酶同工酶分析及活性比较一、实验原理蛋白质和酶都是生物体遗传物质——染色体结构基因 DNA 的初级或次级产物，可以看做是结构基因的一种外部标记物。
不同种乃至不同变种的生物不但外部形态有变异，由于结构基因的差别，其表达产物酶和蛋白质也必然存在着一定的差别。
所以同工酶分析作为一种遗传分析手段已广泛应用于品种资源调查、杂交子代测定、种子纯度鉴定等农林业各个领域，在指导生产方面发挥了很大的作用。
此外，同工酶分析对研究不同产地、不同种属生物间的亲源关系和开发利用药植物资源方面也有积极的意义。
本实验采用聚丙烯酸胺凝胶电泳分析比较过氧化物同工酶，并用愈创木酚法测定其活性。
二、实验器材和试剂1 、电泳所用试剂同“常规聚丙烯酸胺凝胶电泳”。
2 、测活试剂：愈创木酚、联苯胺、冰乙酸、乙酸钠、硫酸锰、过氧化氢。
三、实验方法1 、样品液制备：取材料茎部 1g 加两倍冷纯净水，在冰箱预先冷却的研钵中充分研成匀浆，然后离心（ 3 500r/min ， 20min ），加等体积甘油和少许溴酚蓝指示剂即可。
2 、凝胶制备（按“常规聚丙烯酸胺凝胶电泳”），加样量 40μl/ 孔，电压 180V ，电泳时间 2.5~3h 。
3 、染色： 0.5g 联苯胺溶于 250ml 10 ％冰乙酸，配成联苯胺母液。
1.5g 愈创木酚溶于 250ml 10% 冰乙酸，配成母液。
染色液为 100ml 0.2mol/L 乙酸钠溶液， 10ml 5mmol/L 硫酸锰溶液， 25ml 联苯胺母液， 40ml 愈创木酚母液， 25ml 0.12 ％过氧化氢溶液（临用前配制）。
凝胶洗出后转移至染色液中，37 ℃恒温下放置 30min ，显色后，置 7 ％乙酸中保存，绘图或照相。
实验 48 过氧化物酶活性的测定
实验48 过氧化物酶活性的测定（比色法）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
一、原理在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料马铃薯块茎。
（二）试剂1 ．100 mmol ／L 磷酸缓冲液pH6.0 （见附录）。
2 ．反应混合液：100 mmol ／L 磷酸缓冲液（pH6.0 ）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30 % 过氧化氢19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。
（三）仪器设备分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL 容量瓶，吸管，离心机。
三、实验步骤1 ．称取植物材料1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000 r ／min 离心15 min ，上清液转入100 mL 容量瓶中，残渣再用5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。
2 ．取光径1 cm 比色杯2 只，于1 只中加入反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液1mL ，作为对照，另1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液1mL （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470 nm 下吸光度值，每隔1min 读数一次。
四、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重）] 表示之。
也可以用每min 内 A 470 变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位（u ）表示。
过氧化物酶活性[u/ （g · min ）]=式中：Δ A 470 ——反应时间内吸光度的变化。
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实验08 植物过氧化物酶同工酶测定 （园盘式凝胶电泳法）
一、原理
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)和交联 剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而 成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶 浓度和交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效 应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数 量、分子大小和形状的差异，在电泳时会产生 不同的泳动速率而相互分离。
（四）点样 （五）电泳
（六）剥管，放入培养皿中。用一个带有长针头的注射器，吸满 水，将针头沿管壁插入，同时慢慢地将注射器中的水推 出，并不断转动凝胶管，将凝胶管挤脱出来。 （七）染色
取0.5mL联苯胺母液 + 9.3mL H2O +0.2mL 3% H2O2，混匀后倒入盛有凝胶条的培养皿。此时可以看 到胶条上出现蓝色或棕褐色环，即过氧化物酶酶带，约 10min后用自来水冲洗，此时蓝色带会慢慢变为棕褐色 条带。
四、结果
用尺子量出各酶带和溴酚蓝的迁移距离，计 算各同工酶的迁移率，并划出同工酶图谱。
28S 18S
二、材料、设备与试剂
（一 ）实验材料 ：小麦芽。 （二）设备 ：1.冷冻离心机；2.稳流稳压电泳 仪；3. 电泳槽（园盘型）等。 （三）试剂
1.分离胶缓冲液 2.分离胶贮液： 3.过硫酸铵：现配现用。
4.四甲基乙二胺(TEMED)。 5.电极缓冲液：Tris6.0g，Gly（甘氨酸） 28.8g，用水定容至1000mL(pH8.3)，用前稀释 10倍。
6. 3% H2O2。 7. 联苯胺染色母液：联苯胺1g + 冰醋酸 18mL+ H2O 2mL溶解后贮于棕色瓶中。 8.同工酶染色液：配后立即使用。取0.5mL 联苯胺母液 + 9.3mL H2O +0.2mL 3% H2O2。
三、实验步骤
（一）过氧化物酶的提取 （二）电泳槽的安装 （三）分离胶的配制
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶， 植物体内许多生理代谢过程受其同工酶的种 类及活性的调节。同工酶具有不同的迁移速 度。
将电泳后的凝胶置于含有H2O2及联苯胺 的溶液中染色，利用过氧化物酶催化H2O2分 解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原 理，出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物 酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带 即构成过氧化物酶同工酶酶谱。