固定化乳糖酶制备低乳糖牛奶的研究进展
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因此，就中国乳品业来说，一方面牛乳是人 类最佳的饮食，需要大力普及全民营养知识，让 广大消费者自觉饮用牛乳，以更好地增加国民体 质； 另一方面，由于乳糖不耐症，有很多人无法
充分利用牛乳，这对牛乳的生产及消费的增长具 有较大的阻碍作用。降低牛乳中的乳糖含量，对 于满足乳糖不耐症患者的乳品消费需求，以及促 进我国乳品工业的发展具有重要的意义。
卜建斌，云战友［23］以酰肼颗粒为载体、戊二 醛为交联剂，通过共价结合制得固定化乳糖酶， 对它的特性进行了研究。结果表明，固定化乳糖 酶的最适反应温度为 38 41℃ ，最适反应 pH 值 为 6. 5 7. 0，动力学常数 Km = 304. 87mmol / L， Vmax = 0. 10mmol / （ g · min） ，固 定 化 酶 在 较 低 温度下的使用稳定性好，在 10℃ 下反应 65 个批 次后 活 性 仅 降 低 15. 8% ， 而 在 室 温 下 （ 24 26℃ ） 经过 65 批的反应活性下降将近 50% 。 2. 4 多种方法共用
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2. 2 交联法 （ cross － linking） 使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联
反应，生成不溶于水的二维交联聚集体。作为交 联剂的有形成希夫碱的戊二醛，形成肤键的异氰 酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺等，其 中戊二醛最为常用［13］。但是交联法一般不单独使 用，而是与其他方法结合一块使用。
酶会使牛奶掺入外来蛋白以及使用游离乳酶酶提高了生产成本，从而使乳糖酶的应用受到限制。将乳糖酶固
定化后既可以重复使用，又能连续操作，且缩短了处理时间，从而明显降低了使用成本，因此对于乳糖酶的
固定化受到了酶学专家的关注。本文简要介绍了乳糖和乳糖酶及其分类、乳糖酶的固定化方法及其应用，包
括包埋法、交联法、吸附法、结合法及多种方法的混合使用及国内外的研究现状，并简要介绍了固定化乳糖
* 通讯作者
项目基金： 北京市科技计划 （ D10110504600000） ，“十一五” 科技支撑计划 （ 2009BADB9B06） 。
作者简介： 孙东跃 （ 1960 年 － ） ，男，副教授，研究方向为食品工程。
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的 1 /5［1］。 乳糖酶存在于各种动植物以及微生物中，包
括 β － 半乳糖苷酶、酸性 β － 半乳糖苷酶和异 β － 半乳糖苷酶，而后两种酶很少对乳糖起作用， 一般来说，一般用来生产低乳糖牛乳的是 β － 半 乳糖苷酶。其作用就是在特定的条件下水解 β － D － 半乳糖苷键，将乳糖水解成 α － D － 葡萄糖和 β － D － 半乳糖，乳糖酶同时也具有半乳糖苷的转 移作用，能把半乳糖连接到乳糖上，生成低聚半 乳糖。乳糖酶是一种白色粉末，无嗅无味，溶解 后是一种浅棕色的液体，是一种无毒副作用的生 物酶制剂［2］。
1 前言
1. 1 乳糖和乳糖酶 乳糖是所有哺乳动物乳中主要碳水化合物之
一。系统命名为 4 － β － D － 半乳糖苷 － β － D － 葡 萄糖。牛 乳 中 乳 糖 含 量 约 为 4. 8% ， 占 总 糖 的 99. 8% ，它是牛乳甜味的来源，其甜味约为蔗糖
收稿日期： 2012 － 03 － 01
Quinn 等用铅板作为酶的载体，因铅板具有 较高的空隙度，较高的机械强度、较好的稳定性 和安全性。为了将酶固定在铅板上，可将铅板浸 在酶液中，在室温下用一夜时间完成 酶、戊 二 醛、牛血清蛋白间的交联过程。在 4℃ 冷藏 30d， 以 ONPG 为底物测定乳糖酶的活性，30d 后其钝 化率为 86% ，而温 度 对 酶 活 影 响 的 研 究 结 果 表 明，该酶在 45℃ 不稳定，37℃ 稳定。通过交联法 将酶固定在铅板的表面，在生产条件下对于转化 乳糖具有很好的活性和稳定性［21］。 2. 3 吸附法 （ adsorption）
固定化乳糖酶制备低乳糖牛奶的研究进展
孙成行1 ，陈历俊2*
（ 1. 朝阳师范高等专科学校，朝阳 122000； 2． 北京三元食品股份有限公司，北京 100076）
摘 要： 不同来源的 β － 半乳糖苷酶已经用于水解牛乳或乳清中的乳糖。酶水解乳糖的基本产物为葡萄
糖和半乳糖。经水解后的乳糖增加了产品的甜度并使得牛乳适于那些患乳糖不耐症的人群。由于用游离乳糖
β － 半乳糖苷酶存在于植物 （ 尤其是杏、桃、 苹果） ，细菌 （ 大肠杆菌、乳酸菌等） ，真菌 （ 米 曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、热带假丝 酵母等） ，放线菌以及哺乳动物 （ 特别是婴儿） 的肠道中［3 － 4］。目前仅来源于微生物的 β － 半乳 糖苷酶有工业应用价值，利用微生物发酵法制取 β － 半乳糖苷酶，酶源丰富，产量高，生产成本 低，周期短，而且不受季节、地理位置等因素的 影响。不同微生物来源的 β － 半乳糖苷酶的性质 会有所不同［5 － 6］。 1. 2 低乳糖牛奶的意义
潘晓亚、马力［20］等用明胶作为固定化乳糖酶 的载体，研究载体的用量、交联剂的浓度、酶用 量、制备的 pH 和混匀搅拌时间对固定后乳糖酶 活力的影响。结果表明，选择 15% （ w / v，下同） 的明胶为载体，0. 5% （ w / v，下同） 的戊二醛为 交 联 剂， 酶 用 量 为 0. 05% （ w / v， 下 同 ） ， 在 pH7. 2，混和搅拌时间为 3min 的条件下制备固定 化乳糖酶，其酶活力回收率可达 78. 12% ，重复 回收使用 7 次后，酶活力还可以保留 75% 以上。
牛乳含有 优 质 的 动 物 蛋 白 质、 脂 肪、 乳 糖、 多种矿物质及维生素，被誉为 “营养价值最接近 于完善 的 天 然 食 物 ”［7］。 正 常 生 理 条 件 下， 乳 糖 经小肠内乳糖酶作用后，水解成葡萄糖和半乳糖 才能被人体吸收，人体内若缺乏乳糖酶，乳糖就 会保留在肠腔中，造成等渗性水滞留和结肠细菌 酵解乳糖而产生多种气体及短链脂肪酸，从而发 生腹胀、 肠 鸣、 排 气 增 多、 腹 泻 和 腹 痛 等 症 状， 这就是所谓的乳糖不耐受现象［8］。调查发现，有 色人种， 尤 其 是 东 方 人 中 有 乳 糖 不 耐 症 的 人 较 多，3 5 岁时为 22. 1% ，7 8 岁时为 39. 0% ， 11 13 岁时为 36. 8% ，成人时更多。我国成年 人饮 用 牛 乳 后 乳 糖 吸 收 不 良 的 发 病 率 高 达 86. 7% ，不耐受指数为 0. 9%［9］，而且我国南方 地区比北方地区的人不适宜症更多些。
SUN Cheng-xing1 ，CHEN Li-jun2*
（ 1． Chaoyang Teachers College，Chaoyang 122000； 2． Beijing Sanyuan Foods Co． ，Ltd． ，Beijing 100076）
Abstract： β － Galactosidases from different sources are currently being used in the production of lactose free milk products． The enzyme hydrolyzes the milk sugar，lactose and change them to glucose and galactose． Hydrolysis of lactose increases sweetness and it is suitable for people who suffer from lactose intolerance． Because β － Galactosidases will produce external proteins to the milk and its cost in milk production，the application of galactosidases is limited． However，if it is immobilized，the galactosidases is able to reuse，the operation is continuous and the processing time is shorter． This will save the cost of production． Therefore，the immobilization of galactosidases has been paid more attention． This paper briefly introduced the classification of lactose and lactase，the application of immobilized methods， including entrapment、cross － linking、adsorption and the mixed use of the methods above in both domestic and abroad． A brief introduction of the cleaning of the immobilized enzyme was also presented． Key words： β － galactosidase； Immobilization； adsorption； entrapment
包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格 子结构或微胶囊结构中，这样可以防止酶蛋白释 放，但是底物仍能渗入格子内与酶相接触，此法 较为简 单［18］。常 用 的 包 埋 载 体 有 聚 丙 酞 胺、淀 粉、聚乙烯醇、海藻酸盐、胶原、明胶等。
许牡丹 （ 2004 ） 等 人［19］ 以 海 藻 酸 钙 为 载 体、 戊二醛为交联剂，对乳糖酶进行了固定化。结果 表明，0. 3% 的戊二醛，4% 的海藻酸钠，在 4℃ 条件下对 30% 的乳糖酶的固定化率较高。酶促反 应特性测定结果表明，固定化后乳糖酶的稳定性 增强，最适温度范围较非固定化乳糖酶大，最适 pH 不变。
2 乳糖酶的固定化方法研究现状
虽然用游 离 乳 糖 酶 水 解 乳 糖 的 工 艺 较 简 单， 但是由于用游离乳糖酶会使牛奶掺入外来蛋白以 及游离乳搪酶法成本较高，所以使乳糖酶的应用 受到限制。固定化乳糖酶它既可以重复使用，又 能连续操作，缩短了处理时间，明显地降低了使 用成本。因此，在现代工业生产中，β － 半乳糖 苷酶的固定化是一项重要的技术［10 － 12］，在固定化 酶的过程中载体的选择至关重要，通常要考虑功 能基团的选择、渗透性和比表面积、溶解性、机 械刚性和稳定性、对微生物的抵抗性［13 － 17］以及再 使用性等因素。目前常使用的固定化酶的制备方 法大致可分为四类： 包埋法、交联法、共价键结 合法、吸附法。 2. 1 包埋法 （ entrapment）
吸附固定是最简单的方法，它是指通过非特 异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将酶 固定到载体表面，酶与载体之间的亲和力是范德 华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。
王静、贾英民［22］等从 D151、D152、001 × 7 三种树脂中选择了一种吸附率最高的树脂进行乳 糖酶的固定化，通过先吸附后交联的方法固定乳 糖酶，优化 固 定 化 条 件。结 果 表 明，加 酶 量 为 50. 0U / g （ 载体） ，吸附 pH 值为 4. 0，吸附温度 是 25℃ ，吸 附 时 间 24h，交 联 剂 戊 二 醛 浓 度 为 4% ，交联温度是 30℃ ，交联时间是 6h，固定化 效果 最 好。获 得 的 固 定 化 酶 活 力 可 达 11. 8U / g （ 载体） ，固定酶回收率为 37. 2% 。
酶的清洗。
关键词： β － 半乳糖苷酶； 固定化； 吸附； 包埋
中图分类号： TS201. 2 + 5 文献标识码： A
文章编号： 1006 － 2513（ 2012earch of the immobilized lactase in low － lactose milk manufacturing
充分利用牛乳，这对牛乳的生产及消费的增长具 有较大的阻碍作用。降低牛乳中的乳糖含量，对 于满足乳糖不耐症患者的乳品消费需求，以及促 进我国乳品工业的发展具有重要的意义。
卜建斌，云战友［23］以酰肼颗粒为载体、戊二 醛为交联剂，通过共价结合制得固定化乳糖酶， 对它的特性进行了研究。结果表明，固定化乳糖 酶的最适反应温度为 38 41℃ ，最适反应 pH 值 为 6. 5 7. 0，动力学常数 Km = 304. 87mmol / L， Vmax = 0. 10mmol / （ g · min） ，固 定 化 酶 在 较 低 温度下的使用稳定性好，在 10℃ 下反应 65 个批 次后 活 性 仅 降 低 15. 8% ， 而 在 室 温 下 （ 24 26℃ ） 经过 65 批的反应活性下降将近 50% 。 2. 4 多种方法共用
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2. 2 交联法 （ cross － linking） 使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联
反应，生成不溶于水的二维交联聚集体。作为交 联剂的有形成希夫碱的戊二醛，形成肤键的异氰 酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺等，其 中戊二醛最为常用［13］。但是交联法一般不单独使 用，而是与其他方法结合一块使用。
酶会使牛奶掺入外来蛋白以及使用游离乳酶酶提高了生产成本，从而使乳糖酶的应用受到限制。将乳糖酶固
定化后既可以重复使用，又能连续操作，且缩短了处理时间，从而明显降低了使用成本，因此对于乳糖酶的
固定化受到了酶学专家的关注。本文简要介绍了乳糖和乳糖酶及其分类、乳糖酶的固定化方法及其应用，包
括包埋法、交联法、吸附法、结合法及多种方法的混合使用及国内外的研究现状，并简要介绍了固定化乳糖
* 通讯作者
项目基金： 北京市科技计划 （ D10110504600000） ，“十一五” 科技支撑计划 （ 2009BADB9B06） 。
作者简介： 孙东跃 （ 1960 年 － ） ，男，副教授，研究方向为食品工程。
195
的 1 /5［1］。 乳糖酶存在于各种动植物以及微生物中，包
括 β － 半乳糖苷酶、酸性 β － 半乳糖苷酶和异 β － 半乳糖苷酶，而后两种酶很少对乳糖起作用， 一般来说，一般用来生产低乳糖牛乳的是 β － 半 乳糖苷酶。其作用就是在特定的条件下水解 β － D － 半乳糖苷键，将乳糖水解成 α － D － 葡萄糖和 β － D － 半乳糖，乳糖酶同时也具有半乳糖苷的转 移作用，能把半乳糖连接到乳糖上，生成低聚半 乳糖。乳糖酶是一种白色粉末，无嗅无味，溶解 后是一种浅棕色的液体，是一种无毒副作用的生 物酶制剂［2］。
1 前言
1. 1 乳糖和乳糖酶 乳糖是所有哺乳动物乳中主要碳水化合物之
一。系统命名为 4 － β － D － 半乳糖苷 － β － D － 葡 萄糖。牛 乳 中 乳 糖 含 量 约 为 4. 8% ， 占 总 糖 的 99. 8% ，它是牛乳甜味的来源，其甜味约为蔗糖
收稿日期： 2012 － 03 － 01
Quinn 等用铅板作为酶的载体，因铅板具有 较高的空隙度，较高的机械强度、较好的稳定性 和安全性。为了将酶固定在铅板上，可将铅板浸 在酶液中，在室温下用一夜时间完成 酶、戊 二 醛、牛血清蛋白间的交联过程。在 4℃ 冷藏 30d， 以 ONPG 为底物测定乳糖酶的活性，30d 后其钝 化率为 86% ，而温 度 对 酶 活 影 响 的 研 究 结 果 表 明，该酶在 45℃ 不稳定，37℃ 稳定。通过交联法 将酶固定在铅板的表面，在生产条件下对于转化 乳糖具有很好的活性和稳定性［21］。 2. 3 吸附法 （ adsorption）
固定化乳糖酶制备低乳糖牛奶的研究进展
孙成行1 ，陈历俊2*
（ 1. 朝阳师范高等专科学校，朝阳 122000； 2． 北京三元食品股份有限公司，北京 100076）
摘 要： 不同来源的 β － 半乳糖苷酶已经用于水解牛乳或乳清中的乳糖。酶水解乳糖的基本产物为葡萄
糖和半乳糖。经水解后的乳糖增加了产品的甜度并使得牛乳适于那些患乳糖不耐症的人群。由于用游离乳糖
β － 半乳糖苷酶存在于植物 （ 尤其是杏、桃、 苹果） ，细菌 （ 大肠杆菌、乳酸菌等） ，真菌 （ 米 曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、热带假丝 酵母等） ，放线菌以及哺乳动物 （ 特别是婴儿） 的肠道中［3 － 4］。目前仅来源于微生物的 β － 半乳 糖苷酶有工业应用价值，利用微生物发酵法制取 β － 半乳糖苷酶，酶源丰富，产量高，生产成本 低，周期短，而且不受季节、地理位置等因素的 影响。不同微生物来源的 β － 半乳糖苷酶的性质 会有所不同［5 － 6］。 1. 2 低乳糖牛奶的意义
潘晓亚、马力［20］等用明胶作为固定化乳糖酶 的载体，研究载体的用量、交联剂的浓度、酶用 量、制备的 pH 和混匀搅拌时间对固定后乳糖酶 活力的影响。结果表明，选择 15% （ w / v，下同） 的明胶为载体，0. 5% （ w / v，下同） 的戊二醛为 交 联 剂， 酶 用 量 为 0. 05% （ w / v， 下 同 ） ， 在 pH7. 2，混和搅拌时间为 3min 的条件下制备固定 化乳糖酶，其酶活力回收率可达 78. 12% ，重复 回收使用 7 次后，酶活力还可以保留 75% 以上。
牛乳含有 优 质 的 动 物 蛋 白 质、 脂 肪、 乳 糖、 多种矿物质及维生素，被誉为 “营养价值最接近 于完善 的 天 然 食 物 ”［7］。 正 常 生 理 条 件 下， 乳 糖 经小肠内乳糖酶作用后，水解成葡萄糖和半乳糖 才能被人体吸收，人体内若缺乏乳糖酶，乳糖就 会保留在肠腔中，造成等渗性水滞留和结肠细菌 酵解乳糖而产生多种气体及短链脂肪酸，从而发 生腹胀、 肠 鸣、 排 气 增 多、 腹 泻 和 腹 痛 等 症 状， 这就是所谓的乳糖不耐受现象［8］。调查发现，有 色人种， 尤 其 是 东 方 人 中 有 乳 糖 不 耐 症 的 人 较 多，3 5 岁时为 22. 1% ，7 8 岁时为 39. 0% ， 11 13 岁时为 36. 8% ，成人时更多。我国成年 人饮 用 牛 乳 后 乳 糖 吸 收 不 良 的 发 病 率 高 达 86. 7% ，不耐受指数为 0. 9%［9］，而且我国南方 地区比北方地区的人不适宜症更多些。
SUN Cheng-xing1 ，CHEN Li-jun2*
（ 1． Chaoyang Teachers College，Chaoyang 122000； 2． Beijing Sanyuan Foods Co． ，Ltd． ，Beijing 100076）
Abstract： β － Galactosidases from different sources are currently being used in the production of lactose free milk products． The enzyme hydrolyzes the milk sugar，lactose and change them to glucose and galactose． Hydrolysis of lactose increases sweetness and it is suitable for people who suffer from lactose intolerance． Because β － Galactosidases will produce external proteins to the milk and its cost in milk production，the application of galactosidases is limited． However，if it is immobilized，the galactosidases is able to reuse，the operation is continuous and the processing time is shorter． This will save the cost of production． Therefore，the immobilization of galactosidases has been paid more attention． This paper briefly introduced the classification of lactose and lactase，the application of immobilized methods， including entrapment、cross － linking、adsorption and the mixed use of the methods above in both domestic and abroad． A brief introduction of the cleaning of the immobilized enzyme was also presented． Key words： β － galactosidase； Immobilization； adsorption； entrapment
包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格 子结构或微胶囊结构中，这样可以防止酶蛋白释 放，但是底物仍能渗入格子内与酶相接触，此法 较为简 单［18］。常 用 的 包 埋 载 体 有 聚 丙 酞 胺、淀 粉、聚乙烯醇、海藻酸盐、胶原、明胶等。
许牡丹 （ 2004 ） 等 人［19］ 以 海 藻 酸 钙 为 载 体、 戊二醛为交联剂，对乳糖酶进行了固定化。结果 表明，0. 3% 的戊二醛，4% 的海藻酸钠，在 4℃ 条件下对 30% 的乳糖酶的固定化率较高。酶促反 应特性测定结果表明，固定化后乳糖酶的稳定性 增强，最适温度范围较非固定化乳糖酶大，最适 pH 不变。
2 乳糖酶的固定化方法研究现状
虽然用游 离 乳 糖 酶 水 解 乳 糖 的 工 艺 较 简 单， 但是由于用游离乳糖酶会使牛奶掺入外来蛋白以 及游离乳搪酶法成本较高，所以使乳糖酶的应用 受到限制。固定化乳糖酶它既可以重复使用，又 能连续操作，缩短了处理时间，明显地降低了使 用成本。因此，在现代工业生产中，β － 半乳糖 苷酶的固定化是一项重要的技术［10 － 12］，在固定化 酶的过程中载体的选择至关重要，通常要考虑功 能基团的选择、渗透性和比表面积、溶解性、机 械刚性和稳定性、对微生物的抵抗性［13 － 17］以及再 使用性等因素。目前常使用的固定化酶的制备方 法大致可分为四类： 包埋法、交联法、共价键结 合法、吸附法。 2. 1 包埋法 （ entrapment）
吸附固定是最简单的方法，它是指通过非特 异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将酶 固定到载体表面，酶与载体之间的亲和力是范德 华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。
王静、贾英民［22］等从 D151、D152、001 × 7 三种树脂中选择了一种吸附率最高的树脂进行乳 糖酶的固定化，通过先吸附后交联的方法固定乳 糖酶，优化 固 定 化 条 件。结 果 表 明，加 酶 量 为 50. 0U / g （ 载体） ，吸附 pH 值为 4. 0，吸附温度 是 25℃ ，吸 附 时 间 24h，交 联 剂 戊 二 醛 浓 度 为 4% ，交联温度是 30℃ ，交联时间是 6h，固定化 效果 最 好。获 得 的 固 定 化 酶 活 力 可 达 11. 8U / g （ 载体） ，固定酶回收率为 37. 2% 。
酶的清洗。
关键词： β － 半乳糖苷酶； 固定化； 吸附； 包埋
中图分类号： TS201. 2 + 5 文献标识码： A
文章编号： 1006 － 2513（ 2012earch of the immobilized lactase in low － lactose milk manufacturing