western blot实验技术要点

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分离蛋白范围 >150KD
100-150KD 60-100KD 20-60KD
<20KD
两个目的蛋白分子量相差较小,可以适当降低胶浓度
03 Part Three 蛋白转印与封闭
转印技术要点
膜与滤纸要干净、保持湿润
A
发热问题 F
E
转印时间控制
凝胶不能扭曲
B
C 正负极方向问题
D
气泡问题
封闭
封闭目的 封闭试剂 封闭条件
02 Part Two SDS-PAGE电泳
基本原理






A 浓缩
B 分离
低浓度胶
高浓度胶
A
电荷 量
B
分子 量
电泳技术要点
蛋白分子量
选择合适浓 度的分离胶
样品混匀 浓缩胶足够 目的带之间分开
上样要求 浓缩与分离
试剂的纯度 缓冲液 气泡
影响电泳的 因素
胶浓度的选择
凝胶浓度 6% 8% 10% 12% 15%
03
膜的保存
TBST浸泡、4℃ 可保存1-3天
常见问题与原因分析
背景不干净
A
杂带太多 F
B 条带不均一
条带不完整 E
C 条带模糊不清
D
条带歪斜
T 谢谢观看 HANK YOU!
低温、快速操作

避免反复冻融
03
蛋白处理至关重要
保证浓度足够高
01

(细胞、裂解液的量)

02
浓度测量要准
(混匀、稀释、复孔)

浓度调一致
03
最佳上样量经验总结
1.5mm玻璃板、10孔梳子,上样量:15-25μl 1.0mm玻璃板、10孔梳子,上样量:10-20μl 上样尽可能不超出每孔总体积的一半 内参10ug左右,即可清晰显出
占据蛋白未结合位点 TBST溶解脱脂牛奶或BSA
室温1h或4℃过夜
04 Part Four
抗体孵育
抗体孵育
抗体稀释
孵育条件
注意事项
脱脂牛奶 BSA
抗体稀释液
室温1-2h
或 4℃过夜
抗体比例 充分洗涤 摇床速度
05 Part Five 蛋白检测
蛋白检测
01显影剂Leabharlann 育均匀、快速滴加02
曝光时间
避免过度曝光
Western blot(WB)实验技术要点
太和医院检验部
WB操作流程
样品处理
A
转印与封闭
C
蛋白检测
E
B
SDS-PAGE电泳
D
抗体孵育
失败!
理想的WB图片
1
2
3
背景干净 条带清晰
条带均一 间距相同
内参一致 差异突出
01 Part One 蛋白处理要点
蛋白处理至关重要
蛋白酶抑制剂
01


02
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