血清标志物发现研究的一般流程

HuProt™人类全蛋白质组芯片用于全局性的

血清自身抗体标志物的发现研究

技术背景：

血清标志物的发现对于早期、及时、准确的疾病诊断至关重要。利用蛋白质组芯片进行全局性、系统性地筛查对于特定疾病的生物标志物是一项有着巨大价值的研究工作。HuProt TM人类蛋白质组芯片包含~20,000个人源重组蛋白质，是目前世界上通量最高的蛋白质芯片。该芯片适用于全局性地进行蛋白-蛋白互作、蛋白-核酸互作、蛋白-小分子互作以及翻译后修饰研究，同时适用于系统性地发现肿瘤相关抗原的研究，以发现可用于诊断或其它表征的标志物。

实验原理：

在血清标志物研究中，样本包括实验组和对照组，分别独立地与芯片反应，以检测实验组中针对某一种或几种抗原蛋白，具有普遍性的特异性的抗体（IgG或IgM），这些抗原蛋白可以作为诊断标志物来表征疾病状态。特异性的抗体（包括IgG、IgM或其它类型抗体）与固定于芯片上的蛋白进行结合，清洗去除未结合的抗体和其它蛋白质，再用抗人IgM荧光标记二抗（cy5标记，呈现红色）和抗人IgG荧光二抗（cy3标记，呈现绿色）检测，通过荧光扫描仪读取信号，信号的强弱与抗体的亲和力和数量呈正相关。

实施方案举例：

第一步，初筛：低成本探索性实验

——初步结果可以用来申请课题；

使用涵盖~20,000个人类重组蛋白的HuProt TM Proteome Microarray（组芯片）进行初步筛选，以发现具有一定差异的潜在的自身抗原。具体方案：

疾病组：10－30例；要求：典型的病例样本；明确的临床诊断结论；样本保存完好（－80度保存）；完善度临床信息（如用药或治疗情况等）；

健康对照组：各10-30例；要求：整体的性别、年龄同疾病组相当；样本保存完好。

数据分析：

因样本量较少，因此以较低的标准对潜在标志物进行选择：P值<0.05; 或阳性率在疾病组一致性或显著高于健康对照组。潜在标志物个数控制在200个蛋白以内。

第二步，验证：高效率，大样本，低单价验证

——基本数据可以很快发篇文章，申请若干专利；

基于第一部分的数据，依照潜在标志物列表，定制芯片（focused Array）。然后用更大规模的样本进行统计学验证。具体：

疾病组：>100例；

健康组：>100 例；

疾病对照组：>100例；

以上各组整体的性别、年龄同疾病组相当；样本保存完好。

每12例样本对应1张芯片（12个重复阵列），并获得所有响应数据。

数据分析：

对上述大量样本的响应值进行分析，依据P value和阳性率评价潜在标志物的区分能力，并绘制boxplot，Heatmap图等统计可视化分析；另外，构建区分函数，选定一组（或一个）联合诊断标志物组，通过ROC曲线评价其特异性和灵敏度。

第三步，临床测试：严格的诊断指标评价

——进一步诊断试剂的开发，巨大商业价值

基于前两部分，制定基于联合诊断标志物的诊断芯片或基于ELISA等经典方法，进行进一步验证，开发商业试剂盒。

同时，基于发现的自身抗原，进一步发掘其致病机理，贡献于基础研究，甚至于药物开发。