噬菌体展示技术和酵母双杂交体系
蛋白的酵母双杂交实验原理及其应用
ds cDNA
在酵母体内利用同源重组 形成完整的质粒3、从cDNA筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白
方法1：将转化诱饵表达）进行mating，然后将mating产物涂SD/-Trp-Leu平 板。随后挑取直径在2-3mm的菌落划线接种在SD/-Ade-His-Trp-Leu/X-
GAL 1 UAS
Promoter
reporter gene
图1 转录因子活化示意图
目前使用的酵母双杂交系统有LexA系统和Gal4系统两种： 1、LexA系统。BD由一个完整的原核蛋白LexA构成，AD由一个88个aa的酸 性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录；
2、Gal4系统。BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域（1-147aa与
HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已之间的联系，建 立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢
途径等有重要意义。 Dyer等通过酵母双杂交技术，绘制出了人与致病性
细菌蛋白间相互作用的基因组蛋白网络连锁图，为深入研究人与致病菌间 的相互作用关系奠定了基础（见图4）。
、SD/-His-Trp/x-α-Gal、SD/-Trp-Leu/x-α-Gal平板上划线，观察
菌落的生长情况和颜色变化。 （2）毒性的检测
挑取一个直径2-3mm的克隆于5mL SD/-Trp液体培养基中培养过夜，
检测其OD600nm。若OD600nm≧0.8，表明没有毒性；若OD600nm＜0.8，表 明诱饵蛋白对酵母细胞有毒性。 只有当诱饵表达载体对报告基因无自激活作用，同时诱饵蛋白对宿 主细胞无毒性作用时才能用于酵母双杂交实验。否则只能重新构建诱饵 表达载体。
Synphilin-1，并证明了Synphilin-1 与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的
分子诊断大题复习参考
基因分类：A.按功能:1.结构基因---编码蛋白和酶分子结构（蛋白基因）；2.调控基因(Regulatory Gene)---调节结构基因表达，包含调节基因、操纵基因和启动基因；3.转录而不翻译的基因（RNA基因）：rRNA基因→rRNA→核仁形成区，核糖体组成。
tRNA基因→tRNA→转运氨基酸。
B.按重要程度: 1.看家基因(House-keeping Gene) : 维持细胞最低限度功能所不可少的基因, 如编码组蛋白基因、编码核糖体蛋白基因、线粒体蛋白基因、糖酵解酶的基因等。
这类基因在所有类型的细胞中都进行表达。
2.必需基因(Essential Gene ): 突变时会引起致死表型的基因.人类单核苷酸的多态性（SNP）的特点及主要用途有哪几个方面？1、疾病的连锁分析与基因的定位：包括复杂疾病（如骨质疏松症、糖尿病、心血管疾病、精神性紊乱、各种肿瘤等）的基因定位、关联分析，并可用于遗传病的单倍型诊断。
2、指导用药和药物设计：SNP 多态性能充分反映个体间的遗传差异。
通过研究遗传多态性与个体对药物敏感性或耐受性的相关性, 可以阐明遗传因素对药物效用的影响, 从而对医生针对性的用药和药物的开发提供指导和依据。
3、用于进化和种群多样性的研究：生物界的进化及进化过程中物种多样性的形成与基因组的突变和突变的选择密切相关, 构建整个基因组的SNP 图谱对于直接研究人类的起源、进化具极大意义。
对比人群之间SNP 图谱的异同情况可以对人类的起源、迁移等作出估计, 从而理清人类进化过程中源与流的问题。
基因表达的特点：A时间特异性，单细胞生物：特定基因表达严格按特定时间顺序发生。
多细胞生物：基因表达在不同的发育阶段严格按特定时间顺序开启或关闭。
又称为阶段特异性（Stage specificity）。
B, 空间特异性, 在某发育阶段，同一基因在不同组织器官其表达有差异。
又称为细胞特异性（Cell specificity）基因表达的方式: A组成性表达, 某些基因的表达不受内外环境的影响，在个体生长过程中，几乎在所有的组织中持续表达或变化很小。
研究蛋白质相互作用的方法
研究蛋白质相互作用的方法
1. 酵母双杂交呀，这就像是给蛋白质牵红线，看它们能不能对上眼！比如说，我们研究那两个蛋白质，就把它们分别放到酵母里，看它们能不能相互吸引，哇，真的很神奇呢！
2. 免疫共沉淀那也是超厉害的哦！就像是从大部队里精准地捞出我们想要的那两个蛋白质小伙伴。
就像研究细胞里的那两个关键蛋白，通过这个方法把它们一块儿抓出来，看看它们的关系，你说有趣不有趣呀！
3. 亲和层析呀，不就是设个专门的陷阱让目标蛋白质掉进去嘛！举个例子，我们要找那个特定的蛋白质，就设计个跟它特别契合的柱子，让它乖乖进去，然后就能研究它啦，是不是超棒呀！
4. 荧光共振能量转移，哇塞，这简直就是在蛋白质之间观察神秘的能量传递呀！比如说观察那两个发着光的蛋白质，看它们之间能量怎么流动，那感觉真的太奇妙啦！
5. 表面等离子体共振呢，就像是给蛋白质的互动建了一个超级敏感的检测站呀！比如研究那两个蛋白结合的过程，细微的变化都能察觉到，牛不牛啊！
6. 噬菌体展示技术也很有意思呢，就像是让蛋白质在噬菌体这个舞台上展示自己。
比如我们想找和某个分子结合的蛋白质，通过噬菌体就能把它们找出来，多神奇呀！
7. 蛋白质微阵列，这不就是把一堆蛋白质摆出来让人一目了然嘛！像我们把各种蛋白质放在那上面，然后就能快速了解它们之间的关系啦，酷不酷！
8. 生物膜干涉技术呀，就像是在蛋白质的世界里放了一个精准的测量仪。
例如我们想知道那两个蛋白质结合的实时情况，用这个技术就能清楚看到，你说厉害不厉害！
我觉得这些方法各有各的独特之处，都为我们深入研究蛋白质相互作用提供了强大的工具，让我们能更好地理解蛋白质的奥秘！。
噬菌体展示及酵母展示
• PVIII是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于 噬菌体外侧，C端与DNA结合，N端伸出噬 菌体外，每个病毒颗粒有2700个左右PVIII 拷贝。 • 由于PVIll分子较小，只能融合较小的外源 肽段。但优点在于它的拷贝数多，因此该 系统一般用于筛选亲和力较低的配体，在 疫苗开发上具有潜在的应用价值。
酵母细胞壁结构
• 酿酒酵母的细胞壁非常坚硬，主要由位于 细胞膜外的甘露糖蛋白和β-葡聚糖组成。 • 细胞壁具有双层结构，内层是由β- 1，3-葡 聚糖和β- 1，6-葡聚糖连接形成的骨架，外 层是主要由甘露糖蛋白组成的纤维状或毛 刷状的结构。
锚定方式
• 作为锚定蛋白的细胞壁甘露糖蛋白主要存 在两种类型： • 一种与细胞壁非共价松弛连接，可被SDS 抽提； • 另一种与细胞壁共价相连，可用β- 1，3一 或β- 1，6葡聚糖酶消化细胞壁释放出来， 但不能被SDS（十二烷基硫酸钠）抽提。
• 由于酵母展示的蛋白质是紧密锚固在细胞壁上， 可以耐受SDS等的抽提,同时酵母有发酵特性，生 长快，因此在工业上具有很好的应用前景. • 例如，将不同特异的金属结合蛋白表达在酵母表 面，产生的环境进化微生物，可用于废水处理中 吸附金属离子和放射性物质.
• 将具有催化活性的酶固定在酵母细胞壁上，可防 止酶的不可逆抑制，再生酶的活性.
Байду номын сангаас
同时用c-myc（原癌基因）单抗和荧光 素偶联的dextran(葡聚糖）(FITCdextran)标记的细胞可用激光扫描共聚 焦显微镜检测。
• 絮凝素FlolP富含N-和O糖苷连接而形成杆 状构象,在细胞表面的絮凝反应中起着主要 作用。 • Flolp絮凝功能结构域靠近N端，识别细胞壁 中的A甘露聚糖组分并与之非共价结合，引 起细胞聚集成可逆性絮状物。
《酵母双杂交系统》课件
01
明确研究目标，确定需要验证的蛋白间相互作用或筛选与特定
蛋白相互作用的候选蛋白。
挑选合适的酵母菌株
02
根据研究目的选择适合的酵母菌株，如用于筛选候选蛋白的酵
母菌株或用于验证已知相互作用蛋白的酵母菌株。
构建诱饵和猎物蛋白的表达载体
03
将目的蛋白分别克隆到酵母表达载体上，构建诱饵和猎物蛋白
的表达载体。
应用领域
蛋白质互作网络研究
利用酵母双杂交系统可以大规模地筛选蛋白质之间的 相互作用，构建蛋白质互作网络。
疾病机制研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，有助于深入了解 疾病的发生和发展机制。
药物靶点发现
发现新的药物靶点，为药物研发提供新的思路和方向 。
02
酵母双杂交系统的实验流程
准备阶段
确定研究目的
基因表达调控研究
研究转录因子与DNA的结合
利用酵母双杂交系统可以筛选与特定DNA序列结合的转录因子，进而研究其在基因表达调控中的作用 。
发现新的转录因子
通过与已知转录因子的相互作用筛选，可以发现新的转录因子，进一步揭示基因表达调控的机制。
药物发现与设计
寻找药物靶点
利用酵母双杂交系统可以筛选与药物作用靶点相互作用的蛋白质，为药物发现提供潜在 的靶点。
对生命科学领域的影响与贡献
促进基础研究
酵母双杂交系统作为一种强大的研究工具，有助于深入揭示生命 过程的奥秘，推动生命科学领域的基础研究。
疾病机制与治疗研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，为疾病机制的解析和药物研发 提供有力支持。
生物技术产业
酵母双杂交系统的应用有助于推动生物技术产业的发展，如新药发 现、生物制品开发等。
利用噬菌体展示技术研究功能基因组和蛋白质-蛋白质相互作用——与酵母双杂交方法比较
利用噬菌体展示技术研究功能基因组和蛋白质-蛋白质相互作用——与酵母双杂交方法比较张佳娣;石屹峰【摘要】@@ 近年来基因组测序工作已揭示了数以万计的新基因,但是这些基因序列的价值只有当这些数据被翻译成蛋白质功能的时候才能被了解.而蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分,不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能,而且为我们更好地理解生命过程、疾病机制和新药开发等提供了一个很好的基础.【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2010(005)003【总页数】5页(P211-215)【作者】张佳娣;石屹峰【作者单位】116034,大连工业大学生物与食品工程学院;116034,大连工业大学生物与食品工程学院【正文语种】中文近年来基因组测序工作已揭示了数以万计的新基因，但是这些基因序列的价值只有当这些数据被翻译成蛋白质功能的时候才能被了解。
而蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能，而且为我们更好地理解生命过程、疾病机制和新药开发等提供了一个很好的基础。
当前随着人类基因组和众多生物物种全基因组测序的完成，功能基因组学（functional genomics）成为研究的主流，它是对基因组中包含的全部基因及其所翻译的蛋白质的功能加以解读和描述，尤其是大量未知基因的功能及其对应的蛋白质产物的功能。
在研究功能基因组方面已有许多生物化学和生物物理方法，其中噬菌体展示（phage display technology，PDT）和酵母双杂交（yeast two-hybrid system，Y2H）是比较成熟的生物技术。
噬菌体展示技术诞生于1985 年，在抗体库展示方面取得了巨大的成功，也被用于研究蛋白质-蛋白质相互作用和未知基因克隆等多个分子生物学领域[1]。
酵母双杂交方法诞生于 1989 年，它被广泛用于研究功能基因组和蛋白质-蛋白质相互作用，但是噬菌体展示技术在研究蛋白质-蛋白质相互作用方面具有一些独特的优势[2]。
研究蛋白质之间相互作用的实验方法
研究蛋白质之间相互作用的实验方法一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。
可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。
此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。
二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。
此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。
目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。
三、等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。
它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。
SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。
测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
四、荧光能量转移技术荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。
研究蛋白质的相互作用的方法
研究蛋白质的相互作用的方法一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。
可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。
此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。
二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。
此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。
目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。
三、等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。
它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。
SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。
测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
四、荧光能量转移技术荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。
检测蛋白质互作的常用方法
检测蛋白质互作的常用方法
检测蛋白质互作的常用方法:
蛋白质之间相互作用研究有酵母双杂交系统、噬菌体展示技术、等离子共振技术等方法。
1.酵母双杂交体系其基本原理是：目标蛋白与诱饵蛋白特异性结合后，诱饵蛋白与报告基因的启动子结合，激活了该报告基因在酵母细胞中的表达。
2.噬菌体显示技术是将一种单克隆抗体的 DNA序列连接到噬菌体的外壳上，在噬菌体生长的时候，噬菌体表面就会出现相应的抗体，然后将噬菌体与其对应的抗体进行特异地结合，这就是噬菌体显示技术。
3.等离子体共振技术是近年来蛋白质交互作用的一种新方法。
这种方法主要是用一层纳米膜将诱饵蛋白吸附到目标蛋白上，然后将其与诱饵蛋白结合，从而判断出两者之间的相互作用。
生物分子类实验室常用实验技术原理汇总
一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA 序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA 和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA 相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
遗传学名词解释
名词解释1、Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。
直到掺入一种链终止核苷酸为止。
每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。
终止点由反应中相应的双脱氧而定。
每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
2、Gene targeting vector：基因打靶载体。
是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。
基因打靶技术将广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型的研制以及经济动物遗传物质的改良等方面。
3、基因敲除：是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
4、酵母双杂交系统:在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生物转录因子都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域和转录激活结构域。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
5、表观遗传学（epigenetics）是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生可遗传的遗传信息变化，并最终导致表型的变化。
1）、X染色体失活（2）、DNA甲基化（3）、组蛋白密码（4）、基因组印记6、组蛋白甲基化是指在组蛋白Ｎ末端尾部发生的甲基化修饰，是在组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferases，HMT）的作用下，将活性甲基化合物（如S —腺苷甲硫氨酸）上的甲基转移到靶蛋白赖氨酸残基末端的氨基或是精氨酸残基末端的胍基的过程。
分子生物学实验基本技术
汇报人：
目录
分子生物学实验技 术概述
基因克隆和表达技 术
PCR技术和相关技 术
分子杂交和印迹技 术
基因编辑技术
蛋白质技术和蛋白 质组学
分子生物学实验技 术概述
添加标题
定义：分子生物学实验技术是指在分子水平上研究 生物现象和过程的技术，包括基因克隆、基因表达、 基因突变、基因重组等。
蛋白质组学在分子生物学实验中的应用：研究蛋 白质的功能、调控机制和疾病发生机制等
感谢您的观看
汇报人：
PCR技术和相关技 术
原理：通过DNA复制技术，将DNA片段扩增 步骤：包括模板DNA的制备、引物的设计、反应体系的配置、PCR反应的进行等 应用：广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变检测等领域 相关技术：包括实时荧光定量PCR、多重PCR、巢式PCR等
原理：逆转录-聚合 酶链反应技术，将 RNA逆转录为cDNA， 再进行PCR扩增
添加标题
Northern印迹技术：用于检测RNA序列，通过电泳将RNA片段分离，然后用放射性标记的探 针进行杂交，最后通过放射自显影检测杂交信号。
添加标题
应用：Southern印迹和Northern印迹技术广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变检 测等领域。
添加标题
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
优缺点：Southern印迹技术灵敏度高，但操作复杂，耗时长；Northern印迹技术操作简单， 但灵敏度较低。
基因编辑技术
应用：广泛应用于基因功能 研究、疾病治疗等领域
原理：利用Cas9蛋白对DNA进 行切割，形成双链断裂，从而 实现基因编辑
优势：操作简便、高效、精 确，可应用于多种生物体
局限性：存在脱靶效应，可 能导致非目标基因的突变
蛋白蛋白互作研究方法
整理课件
1
酵母双杂交技术
酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生物转录因子， 如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结 构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个 含有BD基因（假设为B载体）。
3
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的 编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外 壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正 确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况 下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表 达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而 展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白 可以保持相对独立的空间结构和生物活性， 以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相 上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗 去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体 或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体， 洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增， 进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌 体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用 来做进一步富集有期望结合特性的目标噬 菌体。
整理特 性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两 个不具有荧光活性的分子片段N端和C端， 再分别与目标蛋白连接并融合表达，若 连接的两个目标蛋白发生相互作用，使 得两个荧光分子片段N和C端在空间上靠 近，重新形成有活性的荧光基团，在一 定的激发波下，能够观察到相应的生物 荧光，定能够确定目标蛋白相互作用的 时间，位置，强弱，稳定性等。
酵母三杂交系统
酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是 它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互 作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。 第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子， 如下图所示：
酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交
转录因子
能直接或间接辨认和结合上游区段DNA 的蛋白质----反式作用因子. 其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的 称为转录因子(TF). 相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为 TF Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 真核生物的TFⅡ又分为TFⅡ A与TFⅡ B
真核生物转录起始前复合物
GAL1 UAS
（上游激活序列）
启动子
Lac Z(报告基因)
缺陷型宿主菌株
常见的有SF562和HF7c. 特点： 无表达GAL4转录激活因子的能力
载体------穿梭质粒
pGBT9, 又称DNA-BD质粒载体。靶基 因插入可与GAL4-BD形成融合蛋白Ⅰ。 pGAD424，又称AD质粒载体。靶基因 插入可与GAL4-AD形成融合蛋白Ⅱ。 二者均可在大肠杆菌和酿酒酵母中自主复 制。 两种融合蛋白可在酵母中高表达。在核定 位序列作用下，进入酵母细胞核内。
用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分 开，并放在同一宿主细胞中表达。
将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质 Bait protein的基因构建在同一个表达 载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白 BD-Bait proteiRARY表达载体上。
基本原理
DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147 氨基酸 转录激活域（AD）：C端786-881氨基 酸
DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的 激活序列（UAS） ，并与之结合 AD：通过同转录机制(transcription machinery)的其它成分之间的结合以启 动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。
育种--酵母双杂交
酵母转录因子（ 酵母转录因子（Gal 4） ）
与BD-fusion ---诱饵（bait） 诱饵（ ） 诱饵 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein） 猎物或靶蛋白（ ）
报告基因（ 报告基因（reporter gene） ）
---Lac Z（编码β-半乳糖苷酶） 半乳糖苷酶） （编码β 半乳糖苷酶
Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭 和 将两个融合蛋白分别构建在穿梭 质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白 质粒上，一个是将 的 与酵母蛋白 SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白 融合；另一个是将 的 和酵母蛋白 融合 SNF4融合。 融合。 融合 其中， 是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激 其中，SNF1是一种丝氨酸 苏氨酸的蛋白激 是一种丝氨酸 是它的一个结合蛋白， 酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是 是它的一个结合蛋白 已知可以相互作用的。 已知可以相互作用的。
（二）酵母双杂交系统的原理
X
DNA-BD
GAL4 UAS
Promoter
lacZ(or HIS) reporter gene
AD
Y
GAL4 UAS Promoter lacZ(or HIS) reporter gene
AD
X
DNA-BD
Y
Promoter
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
transcription
lacZ(or HIS) reporter gene
1989年美国纽约州立大学的 年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述 年美国纽约州立大学的 和 首先描述 了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 了酵母双杂交系统 。 该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过 程的认识。 程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的 参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域： 参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域： DNA结合结构域 结合结构域(BD) 结合结构域 (DNA binding domain)
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• 3、应用 • 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高 度敏感性。 • 主要是由于： • ①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。 • ②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而如免疫共 沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信 号强度。 • ③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形 成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合， 此 三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。 • ④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时， 酵母 表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
Байду номын сангаас
• 2、历史和发展 • 1985年，Smith G P[1]第一次将外源基因插入丝 状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以 融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了 噬菌体展示技术。该技术的主要特点是将特定分 子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在 噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA 中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术把 基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适 当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。近年来， 随着噬菌体展示技术的日益完善，该技术在众多 基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。
• 3、噬菌体展示技术的原理
• 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因 片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读 框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源 多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体 的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可 以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的 识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵 育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗 脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主 细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的 “吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到 高度富集[2]。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有 期望结合特性的目标噬菌体。
• （2）D蛋白展示系统。D蛋白的分子质量为11 ku，参与野 生型λ 噬菌体头部的装配。低温电镜分析表明，D蛋白以 三聚体的形式突出在壳粒表面[13]。当突变型噬菌体基因 组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况下 完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展 示的外源多肽在空间上是可以接近的。病毒颗粒的组装可 以在体内也可以在体外，体外组装即是将D融合蛋白结合 到λ D-噬菌体表面，而体内组装是将含D融合基因的质粒 转化入λ D-溶源的大肠埃希菌菌种中，从而补偿溶源菌所 缺的D蛋白，通过热诱导而组装。该系统有一个很好的特 点，噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制 tRNA活性加以控制，这对于展示那些可以对噬菌体装配造 成损害的蛋白质时特别有用。
二、酵母双杂交体系
• 1、概念 • 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克
隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结 合结构域基因和GAL4激活结构域基因，构建成融合表达载 体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。
2、酵母双杂交系统技术步骤： • 1.将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA 结合域融合构建诱饵质粒； • 2.将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细 的功能筛选相互作用的蛋白。
• λ 噬菌体展示系统
• （1）PV展示系统。λ 噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管 状部分，该管状结构由32个盘状结构组成，每个盘又由6 个PV亚基组成。PV有两个折叠区域，C端的折叠结构域 （非功能区）可供外源序列插入或替换。目前，用PV系统 已成功展示了有活性的大分子蛋白β -半乳糖苷酶（465 ku）和植物外源凝血素BPA（120 ku）等[13]。λ 噬菌体 的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。 该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体， 这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ 噬菌体的尾部装配。
噬菌体展示技术和酵母双杂交体系
一、噬菌体展示技术
• 1、概念 • 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插 入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外 源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白 随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物 技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬 菌体展示系统、λ 噬菌体展示系统、T4噬菌体展 示系统等数种噬菌体展示系统。
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4、噬菌体展示技术的局限性 （1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还 要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容。 （2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能 的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛易被 降解，因此，必差，也是体内选择压力的一个例子。真核细 胞蛋白在细菌中表达差是因为它们的蛋白质合成与折叠机示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒 性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。