微生物实验报告：水中细菌总数和大肠菌群的检测

实验六水中细菌总数和大肠菌群的检测

摘要：本实验以测定公园河流水的细菌总数和大肠菌群的数量，来测定特定地点的水质情况。初步介绍了一种通用的方法来检测水源的健康指标，判定水体的质量。对该实验点的水源作出了定性的评价，以及关于试验中如何提高梯度重复的精度的分析。

关键字：河流水；细菌总数测定；大肠菌群；EMB培养

前言

各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关，因而是评价水质污染程度的重要指标之一。细菌总数是指1mL水样中所含细菌菌落的总数[cfu/g(mL)]，可用稀释平板计数法检测。水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。

特征：G-无芽孢杆菌，兼性厌氧、在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气。

多管发酵法

初发酵：适当稀释样品，乳糖发酵培养，产酸产气；

分离培养：伊红美蓝（EMB）平板上划线分离，出现紫色、粉红色特征性菌落；

复发酵验证：挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。

材料和方法

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：用于水中细菌总数测定

牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5.0 g，琼脂8g，蒸馏水1000ml；pH 7.0

乳糖胆盐蛋白胨培养基：用于初发酵

1×：蛋白胨20g、牛胆盐5g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL（调pH值后加）、水1000mL、pH 7.2－7.4

三倍浓缩液（3×）：除水以外，其余成分取三倍用量

分装：1×的培养基分装9ml/管，3×的培养基分装5ml/管或50ml/瓶，均装上德汉氏小管。灭菌条件：115℃，15min。

EMB培养基：用于大肠菌群菌落鉴定

脱水培养基，按说明书操作，水用量为90%。

水源：紫竹院河水

仪器：高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。

试剂：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂粉，伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0.04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂

具体实验步骤：

1），相关器械的灭菌操作，以及前往紫竹院取少量的样品水。

2），按照上述的配料，无菌操作配置培养基。

3），细菌总数的测定：取上述样品水，一次稀释10-1,10-2,10-3,3个浓度。对于每个浓度，取1ml稀释液加入冷却好的牛肉膏蛋白胨培养基中，立即混匀，每个浓度重复一次。将平皿倒置培养在37℃的温箱24h，计算平皿的细菌总数。

4），大肠菌群的测定：将样品水稀释成100,10-1,10-2,3个梯度。

实验结果与数据分析 1，细菌菌落总数

组别 稀释浓度及菌落数

平板菌落状况

报告方式选取 菌落总数（cfug , cfu/ml

10-1 10-2 10-3 1 12 0 0 均小于30

最低稀释度下菌落数 × 稀释倍数

8.0×10

2 4 0 0 平均

8

2,大肠菌群总数

实验结果 原溶液 10-1 10-2 ck 初发酵

产酸 + + + + + - 产气 + + + + + - EMB

紫黑色

+ + + + + - 粉红色

- 革兰

氏染

色

G -

+ + + +

+

-

- 结论 +

+ + +

+

0 阳性管数 5

3，EMB 数据值计算 查表可得，MPN=ml

ml

10样接种量最大的一管的水指数

MPN

接种量最大的管：1ml

每100ml 水样中菌数最大可能值：230

95%可信限值 上限：700 下限：70 水样的分析得出这样的结果：细菌总数：80个/mL

大肠菌群数：2300个/L

大肠菌群数占细菌总数：2.88%。

根据我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85规定 细菌总数不超过100个，已达标。

大肠菌群不得超过1000个，超标。

经过严格的消毒处理，大肠杆菌不超过10000个，水样达标。

结论：从上述的水样分析，我们可以得出此处的河流水污染不是很严重，作为景观水，已经达到了标准，但是此类水是不能作为饮用水的，可能存在一些粪便的污染，导致大肠菌群的数量过高，倘若经过严格的消毒灭菌，才能饮用。

实验讨论：

1，大肠菌群的定义是什么？、为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？

大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。而由于大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。大量的调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，而且人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。所以大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。

2，EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？

EMB培养基主要包含以下几种物质：蛋白胨，乳糖，蔗糖，磷酸二氢钾，伊红Y，美蓝，蒸馏水。EMB培养基的机制就是靠微生物在发酵过程中，使培养基发生分解，产生大量的氢离子，从而改变培养基的PH，由于提前添加的指示剂，在PH值的改变下，就会发生颜色的变化，从而鉴定生长的菌种。在检测大肠菌群的时候，蛋白胨提供了氮源，磷酸二氢钾提供了磷元素和钾元素，

实验应注意的问题以及改进：

1，样品的问题

由于本实验是一个检测的实验，存在一个严格灭菌的过程。从采样，到最后的分析，整个过程不仅不能让其他杂菌污染，而且还得保证样品中本身细菌的总数基本不损失。1），采样的器械必须是经过严格灭菌的，而且其本身的构造不会对微生物的生存造成威胁。2），由于样品会处于密闭的过程，水中的含氧量会慢慢降低，所以对样品的处理应该尽快处理。

3），对于样品的稀释不应该用蒸馏水，而应该用灭菌的生理盐水，防止细菌吸水裂解死亡。4），整个接种的操作必须正确，不能杀死细菌，或者引入其他杂菌。

2，关于梯度重复的问题

本实验设计到一个很关键的问题，那就是梯度重复。对于一个梯度的实验量的统计和处理，我们常常采用重复，来解决其实验误差所造成的影响，但有些时候重复增加了大量的工作量，却没有根本提高实验的准确性，仅以本实验为例。在对细菌数量测定时候，我们每