多巴胺的测定

荧光法测定大鼠脑组织和血液中单胺类物质的方法探讨：

1、主要仪器：荧光分光光度计（日本产，SHIMADZU RF-5301 PC）；组织高速分散器（上海产，XHF-1）；冷冻离心机（上海产，TGL-16G）；恒温水浴箱；旋涡混合器等。。

2、试剂：剂来源除标明外均为国产分析纯级，试剂配制使用双蒸水。

（1）标准品：重酒石酸去甲肾上腺素；盐酸多巴胺；5-羟色胺硫酸肌酐；5-羟吲哚乙酸为瑞士Fluka产品。

（2）混合标准储存液的配制：分别精确称取上述标准品各 50mg，用 0.01N 盐酸配制成 100 ml 混合标准储存液（500ug/ml），置4℃冰箱保存，临用前稀释成1.25ug/ml应用液。（3）酸性正丁醇：每升正丁醇加入浓盐酸0.85ml，混匀。

（4）正庚烷。

（5）0.1% OPT-10N 盐酸溶液：邻苯二甲醛为瑞士 Fluka 产品，临用前用 10N 盐酸稀释成0.001% OPT-10N盐酸溶液。

（6）0.25%半胱氨酸溶液：用0.1N盐酸新鲜配制。

（7）碘试剂：配制0.02N碘液和5%碘化钠（以70%乙醇溶解），临用前以1∶1体积比混合。（8） 1/15 M ，PH=7.2的磷酸盐缓冲液。

（9） 0.33M碳酸氢钠溶液。

（10）碱性亚硫酸钠溶液：25%亚硫酸钠与5N氢氧化钠在临用前以1∶9体积比混合。（11）0.1M EDTA 试剂：用1M醋酸钠溶液配制，以10N氢氧化钠调节pH至7.0。

3、实验方法：

⑴标本处理：大鼠断头处死，立即取血及脑组织。脑组织用冰生理盐水冲洗，去除血膜、嗅球和小脑，沿脑中线剖开，取一半脑组织吸干水分称重，加入10倍体积的冰酸性正丁醇，用组织分散器匀浆备用。血液静置凝固后用冷冻离心机分离血清，立即加入10倍体积冰酸性正丁醇摇匀。

⑵提取过程：同时制备标准管和空白管，与血、脑标本在相同条件下按下图流程进行提取，获得水相A和水相B。

⑶NE、DA的测定步骤：各管取水相A 0.5ml，按下列流程进行操作：

①水相A 0.5ml＋1/15M 磷酸盐缓冲液 1.5ml＋0.1M EDTA 0.4ml＋碘液0.2ml

②混匀、静置 3min＋碱性磷酸钠（新配）0.4ml

③混匀、静置 3min+5N 醋酸 0.4ml

④混匀，80℃水浴，冷却

⑤测NE荧光测度，激发波长为 382/488

⑥继续沸水浴 20min，冷却

⑦测DA荧光测度，激发波长 325/385。

⑷5-HT的测定步骤：各管取水相A 0.4ml，按以下流程操作：

①水相 A 0.4ml+0.25%半胱氨酸（新配）0.1 ml+0.002% OPT-10N Hcl 3ml

②混匀，沸水浴 10min，冷却

③测各管 5-HT 荧光强度，激发波长为 360/480。

⑸5-HIAA的测定步骤：各管取水相B 0.5 ml，按以下流程操作：

①水相B 0.4 ml+0.25%半胱氨酸（新配）0.1 ml+0.002% OPT-10N Hcl 2.5ml

②混匀，沸水浴 10min，冷却

③测各管 5-HIAA 荧光强度，激发波长 360/480。

复合营养素对认知与运动功能损伤大鼠的干预作用及其机制研究：

脑组织单胺类神经递质—去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)含量的检测：

①称取一定重量的脑组织，在冰浴条件下与预冷的酸化正丁醇以1：10的比例匀浆后，补足液体至4mL，旋涡振荡5min，以3000r／min离心5min，取上清液2.5mL置于反应管内，加入正庚烷5.OmL，0.1mol／L盐酸5.OmL，旋涡振荡5min，以3000r／min离心5min，其水相内含有NE、DA、5-HT。

②NE、DA含量的测定：取水相0.5mL，加入70mmol／L、pH7.2 PBS 1.7ml，碘试剂0.1mL，静置2min，加入碱性亚硫酸钠溶液0.5mL，静置2min，加入6mol／L乙酸溶液0.6mL，煮沸20 min，冷水冷却，用荧光分光光度计在475nm激发光，385nm发射光处测定NE的荧光强度；在370nm激发光，322nm发射光处测定DA的荧光强度。

③5-HT含量的测定：取水相0.5mL，加入5 g／L半胱氨酸0.1mL，40mg／L邻苯二甲醛3mL，煮沸lOmin，冷水冷却，用荧光分光光度计在475nm激发光，350nm发射光处测定5-HT 的荧光强度。

大鼠海马齿状回长时程增强(LTP)的检测：

实验器材：金属电极，立体定位仪，生物电放大器，电刺激器，记忆示波器，计算机，生物数据采样处理软件。

实验步骤：

(1)定位：按1.5 g／kg BW剂量给实验大鼠腹腔注射20％乌拉坦，麻醉后，立体定位仪上固定头部。实施外科手术暴露头顶面颅骨，调节水平。用牙科钻按记录电极(前囟后3.5mm、中缝旁2.Omm)和刺激电极(前囟后8.Omm、中缝旁4.Omm)的位置，同侧各钻开直径约为lmm的小孔，以各植入电极。记录电极和刺激电极的参考电极及地线均与颅顶术面皮肉连接。实验中采用不锈钢针单电极刺激、单电极胞外记录的方法。电极直径0.35mm，外覆绝缘层，尖端裸露。记录电极定位于大鼠海马齿状回(DG)颗粒细胞层(前囟后 3.5mm、中缝旁2.Omm、硬脑膜下3.5mm)，刺激电极定位于同侧的穿行通路(PP)上(前囟后8.Omm、中缝旁4.Omm、硬脑膜下3.Omm)。

(2)诱发群峰电位：实验开始时，用中等电流强度的单刺激(间隔30s，持续0.1ms)诱发DG产生群峰电位(population spike，PS)，记录30～60min。待Ps幅度稳定后，上调刺激电流，使PS达最大；再下调刺激电流，使PS保持在最大峰值的50％，固定此刺激电流，