酸奶中乳酸菌的分离与纯化
酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化
（4）、乳酸菌的检测、纯化培养
(1)、初步检测
恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布 较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌 菌落。乳酸菌的菌落很小，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙， 在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈，如出现圆形稍扁 平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
2、革兰氏染色结果
革兰氏染色结果为蓝紫色，证乳酸菌为革兰氏阳性菌
3、脱脂乳试管检测乳酸杆菌
试管中脱脂牛乳凝固，证为乳酸杆菌
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
另留一管不稀释留作对照（CK）
（2）、分离方法
A．平板划线 接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进
行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培 养48小时。
B．平板涂布 用无菌移液管分别吸取10-5、10-6、10-7和无菌生理
将7只装9ml无菌水的无菌试管，依次编号1--7，再用无菌移液管 吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管1--6中，稀释混匀 便得到10-2～10-7的稀释液。
酸奶菌悬液的配制
10ml
1.0ml
1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水
（2）、乳酸菌的分离纯化培养
选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃ 培养8-24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂 片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性， 则可将其连续传代3次，最终选择出在3-6h能凝固 的牛乳管，作菌种待用。
牛奶中细菌的分离实验报告
牛奶中细菌的分离实验报告乳酸菌的分离和酸奶的制作实验目的：1.掌握分离纯化微生物的基本方法2.掌握酸奶制作的基本原理3.学会酸奶的制作方法。
实验设备与材料，1、仪器设备：三角瓶、平皿、试管、移液管、玻璃涂布棒、灭菌锅、超净工作台、培养箱、恒温摇床、冰箱等。
2、材料：市售酸奶、奶粉、白糖、棉花、酸奶瓶（自备，1个/人）等。
3、培养基：乳酸菌分离用乳酸菌分离用培养基：牛肉膏：0.5％；酵母膏：0.5％；蛋白胨：1％；葡萄糖：1％；乳糖：0.5％；NaCl：0.5％；琼脂：2.5％；pH6.8。
配制250mL/组，装于2个三角瓶。
实验原理，酸奶制作的基本原理：（1）酸奶：以牛奶为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种乳制品饮料。
生理生化原理：牛奶（乳糖）→接种乳酸菌→β-D-半乳糖苷酶→乳糖（半乳糖和葡萄糖）→乳酸发酵（葡萄糖）→乳酸→破坏钙-酪蛋白-磷酸复合物的稳定性→蛋白质凝结→酸奶提供适宜的生长条件、采用一定的微生物分离纯化方法，就能够从酸奶中分离出乳酸菌。
酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对人体的肠胃消化道疾病有良好的治疗效果。
实验方法步骤：乳酸菌的分离纯化——稀释涂布平板法1、倒平板（约6块/100ml）2、制备酸奶稀释液：（1）将0.5mL酸奶吸入4.5mL无菌水（自备）中，摇动5min；（2）用无菌吸管吸出0.5mL酸奶悬液，加入盛有4.5mL无菌水的试管中，充分混匀，制备得到10-2稀释液；（3）再从中吸出0.5mL加入盛有4.5mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3稀释液；（4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6酸奶稀释液。
酸奶制作及乳酸菌的分离计数
酸奶制作及乳酸菌的分离计数1、实验目的1、学习自制酸奶的方法。
2、熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法。
3、掌握用浇注平板法分离微生物纯种。
4、了解简便、快速厌氧菌菌落计数法的基本原理。
5、学习用简便、快速厌氧菌菌落计数法对乳酸菌进行活菌计数。
二、实验原理酸奶又称酸乳，是以牛奶为主要原料，经乳酸菌发酵而制成的一种营养丰富、风味独特、国际流行的保健饮料。
酸奶发酵中的主要生物化学变化是：乳酸菌将牛奶中的乳糖发酵成乳酸使其pH降至酪蛋白等电点附件从而使牛奶形成凝固状；其次，乳酸菌还会触使部分酪蛋白降解、形成乳酸钙和产生一些脂肪、乙醛、双乙酰和定二酮等风味物质。
酸奶发酵过程通常是由双菌或多菌的混合培养实现的。
其中的杆菌先分解酪蛋白为氨基酸和小肽，由此促进球菌的生长，而球菌产生的甲酸又刺激了杆菌产生大量的乳酸和部分乙醛，由此链球菌还产生了双乙酰这类风味的物质，因此，达到了稳定状态的混合发酵。
根据高层半固体培养基具有良好厌氧性能的原理，我们设计了一种适用于乳酸菌等不产气的厌氧菌进行简便快速菌落计数的方法。
此法把稀释（在半固体培养基凝固前）和（在半固体培养基凝固后）集中在同一支试管中内，以不易透氧、装有高层半固体培养基的试管代替常规的培养皿平板进行菌落计数，从而使活菌计数操作简化成“试样分散----逐级稀释+常规培养---菌落计数”3步，而传统的方法则需“试样分散----逐级稀释---涂布或浇注平板---厌氧培养---菌落计数”5步。
因此，本法不仅有简化操作步骤的优点，还有省略专用厌氧培养装置、缩短培养时间以及节约试剂和材料等优点。
3、实验器材1、菌种：德氏乳杆菌保加利亚亚种、唾液链球菌嗜热亚菌（可从品牌酸奶商品中自行分离）2、培养基：（1）LAB半固体培养基100ml（2）MRS琼脂培养基200ml(3)MRS液体培养基10ml3、材料：优质全脂牛奶或奶粉（内含脂肪28%，蛋白石27%，乳糖37%，矿物质6%，水分2%），蔗糖：市售优质酸奶（1瓶）4、器皿：锥形瓶（3个）、空试管（14支）、无菌移液管（1ml*15根，10ml*2根）、培养皿（6套）、涂布棒、量筒、酒精灯、恒温水浴锅，恒温箱，冰箱4、实验步骤1、实验的准备（1）配制LAB半固体培养基100ml，MRS琼脂培养基200ml，MRS液体培养基10ml（2）用量筒各量取自来水225ml至2锥形瓶中，用移液管移取4.5ml至4支试管中（3）将培养基进行分装，用无菌移液管吸取9mlLAB半固体培养至6支试管中，用无菌移液管吸取5mlMRS液体培养基至2根试管中，用无菌移液管吸取10mlMRS琼脂培养基至2根试管中制作两个斜面（4）用报纸进行包扎试管，移液管，锥形瓶，培养皿，然后放入灭菌锅进行灭菌2、酸奶的制作（1）配奶：在牛奶中添加6%~10%蔗糖后搅匀。
乳酸菌的分离与纯化实验报告
乳酸菌的分离与纯化实验报告一、实验目的：1. 掌握乳酸菌的分离与纯化方法；2. 学习乳酸菌的形态特征及生长特性；3. 熟悉微生物实验室操作规范和安全注意事项。
二、实验原理：乳酸菌属于革兰氏阳性细菌，可以利用革兰染色方法进行初步鉴定。
乳酸菌的形态特征有很大差异，有的呈短杆状、短圆柱状，有的呈梭形或球形。
乳酸菌的培养基选择要根据实验目的而定，一般常用的是MRS培养基。
常规乳酸菌分离方法有两种：血漂白法和渐进稀释法。
血漂白法是用过氧化氢或次氯酸钠等对血液进行漂白处理后加入培养基进行分离，由于血液中含有多种抑菌物质，故需漂白处理后方能使用。
渐进稀释法则是将混菌液逐步稀释后按一定比例接种于选定的培养基上，经过多次传代，可得到单一的菌落。
三、实验步骤：1. 取适量样品加入1ml生理盐水中，充分摇匀。
2. 再从上述稀释液中取出1ml加入9ml生理盐水中，得到10-2悬液。
3. 再抽取1ml悬液加入9ml生理盐水中，得到10-3悬液。
4. 分别取适量的10-2和10-3悬液接种于MRS培养基上，并分别转移多次，培养时间一般为24-48小时，必要时可延长到72小时。
5. 分离菌落后进行鉴定。
四、结果及分析：实验结果显示，经过分离培养，从10-2和10-3悬液中分别分离出了多个菌落，经过重复转移，逐步稀释，最终获得了单一的菌落，可见分离培养方法的有效性和行之有效的可行性。
鉴定乳酸菌的一般方法包括形态学鉴定、生化特性鉴定和分子生物学鉴定等。
形态学鉴定包括形态、大小、形状和染色等方面；生化特性鉴定则主要包括代谢途径、酸产生量和果糖发酵能力等；分子生物学鉴定则是通过特异性引物扩增菌株中的核酸，进行分子水平鉴定。
五、实验心得：本次实验通过乳酸菌分离、培养和鉴定的过程，使我对乳酸菌的形态特征、生长特性和鉴定方法有了更深入的了解。
同时，要时刻注意实验室的操作规范和安全问题，确保实验顺利进行。
在今后的实验中，我将更加重视实验操作的规范性和安全性。
酸奶菌种的分离及鉴定（5篇）
酸奶菌种的分离及鉴定（5篇）第一篇：酸奶菌种的分离及鉴定酸奶菌种的分离及鉴定乳酸菌是指一群通过发酵糖类，产生大量乳酸的细菌总称。
乳酸从形态上可分为球菌和杆菌，并且均为革兰氏染色阳性、在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性或厌氧性细菌。
目前，对乳酸菌的应用研究，着重于食品（如发酵乳制品、发酵肉制品和泡菜）和医药工业等人类生活密切相关的领域。
目前市售的各种酸奶制品中, 作为发酵剂的乳酸菌, 通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这两株菌。
用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。
保加利亚乳杆菌（L.Bulgarius）:长杆形，直径1-3mm左右,能产生大量的乳酸。
酸碱度方面,为耐酸或嗜酸性,因低pH能防止一些微生物的生长;温度方面,为嗜温至少许嗜热,最适生长温度在37-45℃之间,对低温非常敏感。
嗜热链球菌（S.thermophilus）：卵圆形，直径0.7－0.9微米，呈对或链状排列，无运动性。
为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。
可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。
本研究对市售主要品牌酸奶中（河南花花乳业生产的酸奶）乳酸菌进行了分离鉴定，并进一步探讨制备酸奶条件（温度、时间等），以达到最佳的天然酸奶质量效果。
一、实验内容（1）乳酸菌的分离纯化1．无菌操作倒平板、十倍稀释、划线分离，恒温培养2．菌落观察与镜检 3．筛选生产用菌株（2）优化酸奶制作条件1．制备发酵液2．不同条件下，接种发酵菌剂并发酵生产 3．观察发酵情况4．品尝发酵产品，进行质量评价 5．记录结果二、实验器材1）菌种：新鲜乳酸饮料（标记只含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）2）试剂：脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯)、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g；3）仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、牛角匙、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线绳、标签、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯、酒精灯、石棉网、接种针（环）、擦镜纸四、实验方法4.1乳酸菌的分离纯化 4.1.1分离(1)配制BCG牛乳培养基，分装三角瓶，包扎，灭菌备用。
乳酸菌的分离纯化
乳酸菌的分离纯化乳酸菌的分离与纯化1.实验目的2.实验材料2.1试验设备天平、牛角匙、电炉、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、试管、棉塞、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签、500mL锥形瓶两个、250mL锥形瓶两个、试管20只、500mL烧杯两个、250mL烧杯两个、100mL 烧杯两个、酒精灯、石棉网、接种针（环）。
2.2实验仪器50L的高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超镜台、光学显微镜、75%酒精棉、冰箱。
2.3实验药品新鲜酸奶、脱脂奶粉或全脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液、酵母膏、琼脂、结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、诗坛酸复红染液。
3.试验方法及操作过程3.1BCG牛乳培养基配方及灭菌（A）液：脱脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。
（B）液：酵母膏1克，水50克，琼脂2克，pH6.8，121℃灭菌2.min。
按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照，加琼脂溶化，加热过程要不断搅拌，可适当补水。
琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中，用纱布包扎好（注意不要污染纱布）再用牛皮纸包扎，贴上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。
在高压锅中，在1kg/cm2压力下维持30min。
3.2倒BCG培养基平板的方法将灭好菌的A液和B液趁热充分混合，点燃酒精灯对周围的空气进行灭菌，并在酒精灯的附近用左手握着平板用拇指和小拇指打开一个小缝，趁热将培养液倒如平板内，倒入的量能使培养基刚要覆盖平板底部，倒好后把平板平放到实验台，轻轻晃动是培养基形成一个平面，等培养基冷却凝固后倒放并贴上标签。
（注意：整个实验要在酒精灯附近做，以保证培养基不染菌）3.3脱脂乳试管的配制与灭菌直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。
酸乳中乳酸菌的分离鉴定及其活力的测定
所以酸奶菌落总数为： 样品的测定与出厂的间隔时间为3d： N=(N1+N2) X A/2=（295+297）X 107/2=296 X 107cfu/mL 样品的测定与出厂的间隔时间为6d： N=(N1+N2) X A/2=（273+271）X 107/2=272 X 107 cfu/mL 样品的测定与出厂的间隔时间为9d： N=(N1+N2)X A/2= （ 212+213 ） X 107/2= 213 X 107cfu/mL 实验分析：酸奶中所含的乳酸菌数，随着 出厂天数的延长会出现明显下降的趋势。
测定乳酸菌的 OD值和产生酸能力来评定酸乳中乳酸菌的活力，
2. 材料与方法
材料与设备
A B 设备：高压灭菌锅 CO2培养箱 电子天平 冰箱 鼓风干燥箱 超净工作台 光学显微镜
材料：蒙牛冠益乳
实验方法
酸奶中乳酸菌的 培养分离 生化试验鉴定 酸奶中乳酸菌
乳酸菌
菌落数的测定
生长曲线的绘制
产酸能力的测定
目录
1 2 3 4 5
概述 材料与方法 结果与分析 结论 致谢
1. 概述
背景
酸奶是日常生活中的一种传统的受欢迎的 发酵型的乳制品，它的营养价值含量相当 的丰富，并且对人体有很好的保健功效。
意义
蒙牛冠益乳中的乳酸菌主要为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。 对乳酸菌活力的测定，判定酸奶的最佳饮用时间，为酸奶的消 费提供科学的依据，同时也对微生物做出研究。
酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化ppt课件
【实验材料、仪器与试剂】
实验材料：市售乳酸饮料或酸奶。 实验仪器：保温箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、 培养皿、试管、涂布器、酒精灯等。 实验试剂：脱脂乳试管、脱脂奶粉、5%蔗糖水、 1.6%溴甲酚紫、95%乙醇溶液、酵母膏、 琼脂、无菌水
【实验步骤】
1、1.6%溴钾酚紫牛乳培养基的制备
2、脱脂乳试管的制备
3、酸奶中乳酸菌的分离 4、乳酸菌的检测、纯化培养
（1）、1.6%溴甲酚紫牛乳培养基的制备
配料： （A）液：脱脂奶粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚紫、乙醇溶液1ml， 80℃灭菌20min。 （B）液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g ，pH6.8， 121℃湿热灭菌20min。 操作： （1）、按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水 量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，加琼脂溶化，加 热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后 倒入250mL的锥形 瓶中，贴上标签，在高压锅中灭菌20min。 （2）、灭好菌的A液和B液趁热充分混合，并在酒精灯的附近趁热倒平板 。
10ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml
10-1
花园酸奶 90ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
另留一管不稀释留作对照（CK）
（2）、分离方法
A．平板划线 接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进 行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培 养48小时。
B．平板涂布
乳酸菌的分离及酸奶的制作
乳酸菌的分离及酸奶的制作乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，常见于发酵食品中，特别是酸奶中。
乳酸菌通过产酸作用，可以改变食品的酸碱度，增强味道和保存食品的能力。
因此乳酸菌的分离和酸奶的制作具有重要的实际意义。
1.选择合适的发酵食品作为样品，如酸奶或发酵乳。
2.将样品进行稀释，然后分别接种在适宜的培养基上，如牛乳琼脂培养基或MRS培养基。
3.培养基应保持在适宜的温度，通常是37°C，促使细菌的生长。
4.观察培养基上的菌落形态，标记明显异于其他菌落的菌落。
5.使用无菌技术，将单独的菌落分离到新的培养基上。
6.对新培养的乳酸菌菌株进行纯化和鉴定，如形态学观察、生理生化特性检测等。
酸奶的制作主要是通过乳酸菌进行发酵来实现的，以下是一种常见的酸奶制作方法：1.选择新鲜的牛乳作为原料，最好使用全脂牛乳，因为全脂牛乳中的脂肪能够提供乳酸菌生长所需的营养。
2.将牛乳煮沸并冷却至40-45°C，这是乳酸菌生长的最适温度。
3.加入适量的酸奶发酵剂，这可以是商业化的酸奶菌干粉或者是之前分离得到的纯化乳酸菌菌株。
4.用搅拌器均匀地搅拌牛乳，以确保发酵剂充分混合。
5.将搅拌均匀的牛乳倒入适宜的容器中，并加盖保温。
可以使用保温箱或温暖的地方来保持发酵温度。
6.将容器放置在温暖的地方，保持温度在37-43°C之间，使乳酸菌进行发酵。
发酵时间通常为6-8小时，但可以根据个人口味和偏好进行调整。
7.发酵完成后，将酸奶放入冰箱冷藏，以停止乳酸菌的发酵过程。
8.酸奶制作完成后，可以根据个人口味添加适量的糖、水果、坚果等作为调味品。
通过乳酸菌的分离和酸奶的制作，我们可以获得高质量的酸奶产品，并且能够自己调整酸奶口味和营养成分。
此外，乳酸菌的分离和酸奶制作对于学术研究和食品工业也具有重要意义，可以深入了解乳酸菌的功能和应用，以及改善食品的质量和口感。
酸奶中乳酸菌的分离与纯化
酸奶中乳酸菌的分离与纯化酸奶中乳酸菌的分离与纯化一、实验目的1.掌握分离乳酸菌的基本原理和操作技术；2.学习并掌握稀释法和微生物纯培养操作。
二、实验设备及材料培养基材料：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、溴甲酚绿、琼脂。
实验材料：无菌水、培养皿、电热套、高压蒸汽灭菌锅、电子分析天平、涂布棒、酒精灯、无菌试管、移液枪、无菌吸管。
三、实验原理乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。
大多数不运动，少数以周毛运动。
菌体常排列成链。
根据细胞形态分为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌和乳酸杆菌。
在乳酸菌培养基平板上，乳酸菌菌落大约1～3mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸周围还能产生CaCO3溶解圈。
乳酸菌革兰氏染色后呈蓝色，为革兰氏阳性菌。
四、实验步骤1.乳酸菌培养基的制作配方牛肉膏 2.0g蛋白胨 2.0g酵母膏 2.0g番茄汁40g葡萄糖 2.0g吐温0.10mL碳酸钙 3.4g溴甲酚绿0.02g琼脂2～4g水200mL①称量：按照培养基配方依次称取药品放入烧杯中。
②熔化：在烧杯中加入略少于200mL水，加热至沸腾。
依次加入药品，用玻璃棒不断搅拌，待其完全溶解后，加入琼脂，搅拌至完全熔化，最后补足所损失的水分。
③分装：将配置的乳酸菌培养基装入三角瓶中。
④加棉塞、包扎⑤灭菌：将乳酸菌培养基在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌20min。
⑥无菌检查2.倒平板将乳酸菌培养基熔化，待冷却至55～60℃时，倒平板，倒好后，在室温下培养2～3d，或37℃培养24h，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。
3.制备稀释液量取酸奶10mL，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震摇约20min，使酸奶与无菌水充分混合，将酸奶分散。
用一只1 mL无菌吸管从中吸取1 mL酸奶悬浊液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。
然后再用一支1 mL无菌吸管从此试管中吸取1 mL注入另一盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成10?3、10?4、10?5各种稀释度的酸奶稀释液。
酸奶中乳酸菌的分离、鉴定及性能研究
1.1 材料与试剂 实验样品为一款来自手工制作的酸奶。 3% 过氧化氢溶液、500 mL 新鲜脱脂乳、0.1 moL
NaOH 溶液、1.6% 溴甲酚紫、氯化钠、2% 酚酞试剂、 莫匹罗星锂盐、半胱氨酸盐酸盐和石蜡油，以上试剂均 为国产分析纯；MRS 琼脂培养基、MRS 肉汤培养基、
作者简介：黄耀雄（1989 －），男，本科，助理工程师；研究方向为食品安全与检验。
分析检测 Analysis and Testing
doi:10.16736/41-1434/ts.2021.03.064
酸奶中乳酸菌的分离、鉴定及性能研究
Study on Isolation, Identification and Performance of Lactic Acid Bacteria in Yogurt
JE1002 型电子天平（上海蒲春计量仪器有限公 司）、BXM-50KB 型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安 医疗器械厂）、LRH-250F 型生化培养箱（上海一恒 科学仪器有限公司）、3WLED 型光学显微镜（重庆 奥特光学仪器有限公司）、HR50- Ⅱ A2 型生物安全 柜（青岛海尔生物医疗股份有限公司）、2720 型 PCR 仪（美国 Applied Biosystems 公司）、PowerpacTM 基 础型电泳仪（美国 BIO-RAD 公司）、AlphaImager EP 通用型凝胶成像系统（美国 Alpha Innotech 公司）及 Z216 MK 型离心机（德国 HERMLE 公司）。 1.3 酸奶中乳酸菌的分离、纯化及鉴定
Keywords：yogurt; lactic acid bacteria; identification; performance
中图分类号：TS252.54
不同乳制品(酸奶)中活性乳酸菌的分离及鉴定
《微生物学综合实验》实验报告2012.10一．实验目的1.从乳制品中分离纯化活性乳酸菌2.利用革兰氏染色等手段对分得菌株进行形态学鉴定3.通过16S rDNA序列测定及分析，鉴定分得菌株的种属4.利用Sequence Scanner V1.0软件及MEGA4软件构建待鉴定菌株的发育树，并进行序列同源性分析；5.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；6.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；7.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌8.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。
了解酸奶中乳酸菌分离原理,观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法9.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。
明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法10.初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法11.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性二．实验原理1.菌株分离纯化平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。
一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而形成多个相互独立的单菌落。
通常认为这种单菌落便为某种微生物的“纯种”。
MRS培养基是经特殊设计，专门用于乳酸菌培养、富集、分离纯化的培养基。
本实验采用划线分离法，在MRS培养基上划线稀释不同品牌的酸奶原液，以期分得乳酸菌纯种。
2.革兰氏染色革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。
鲜奶的乳酸发酵及乳酸杆菌的分离纯化
实验四鲜奶的乳酸发酵及乳酸杆菌的分离纯化一、实验目的1.掌握酸奶的制作工艺;2.掌握乳酸杆菌发酵鲜奶的原理;3.掌握分离纯化乳酸杆菌的方法.二、实验原理无氧，菌乳酸菌糖乳酸酸奶酸奶发酵过程是双菌或多菌的混合培养实现的。
酪蛋白小肽或氨基酸促进球菌生长、甲酸促进杆菌产生中间有大量的乳酸、乙醛、双乙酰产生乳酸菌发酵过程是双菌或多菌的混合培养实现的，酪蛋白分离成小肽或氨基酸，促进球菌的生长，产生大量的乳酸、乙醛、双乙酰。
乳酸菌利用牛奶为底物进行厌氧发酵，得到主要发酵产物乳酸。
三、实验材料与仪器材料：纯牛奶，乳酸菌（益力多），白砂糖；仪器：高压灭菌锅、恒温培养箱。
四、实验步骤（一）酸奶的制作1、配奶：150mL的纯牛奶加15~20g白砂糖，搅拌好，砂糖需完全溶解；2、接种：按总体150mL鲜奶加15mL益力多，桌面上水平摇匀10min；3、装瓶4、保温：40~42度，3~4h，常观察，整瓶上下层均出现凝乳时停止培养，转至4~5度低温下冷藏1~2h。
5、加热：低温后加热6、品尝：口感与风味接种剂品牌PH 凝结程度口感香味异味品评益力多 6.0 无凝结甜，无酸味奶香无太甜（二）乳酸杆菌的分离纯化益力多中乳酸菌的分离，按10倍稀释法，原液大约为109/mL编号 1 2 3 4 5 6 7 810倍108/mL 107/mL 106/mL 105/mL 104/mL 103/mL 102/mL 10/mL 划线法每组做四种浓度，每种浓度2个平行，划八个皿，37度倒置培养。
纯化：划线，染色（划一个单菌落在载玻片，用10uL的水涂匀，烤干，加一滴美篮染色，烤干，加香柏油，在油镜下观察）分离：取以上培养的两个浓度，分别取一个单菌落接到一个新的培养皿上，同样条件继续培养。
五、结果与讨论1、鲜奶的乳酸发酵图一图二图一图二便是我做的乳酸发酵结果，从图中可以明显的看到奶瓶中并未出现凝结情况，牛奶还是呈现液状，开启品尝后发现口味很甜，似乎乳酸菌并未利用糖进行发酵或者是因为我们使用的从超市买回来的罐装鲜奶中含有较高浓度的防腐剂，从而抑制乳酸菌的生长，导致乳酸菌的发酵能力大打折扣，因此鲜奶并未如预期那样成功发酵成酸奶。
乳酸菌的提取和鉴定
酸奶中乳酸菌的筛选试验一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法二、实验原理：市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛奶中乳糖发酵成乳酸，此外酸奶中还含有其他球菌，利用它产酸等性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、亚硫酸铁、吐温-80和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固剂。
、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据。
.筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3 的培养基上产生CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离三、实验药品及仪器牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、蒸馏水。
仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、电子天平、离心机四培养基类型①改良MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml（它是一种很好的乳化剂和分散剂也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀就是对营养成分的再一次优化），K 2HPO4 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂 1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121℃高压灭菌15min②改良MC 培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO3 10g，琼脂20g，中性红0.05g（指示剂），最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌15min。
乳酸菌的分离及饮料的制备
本研究对市售主要品牌酸奶中乳酸菌进行了分离鉴定，并进一步探讨制备酸奶条件（温度、时间等），以达到最佳的天然酸奶质量效果，为广大消费者选购高品质酸奶提供理论支撑。
2．比较采用乳酸菌混合发酵的酸乳比单菌发酵的酸乳口感和风味哪个更佳？为什么？
乳酸菌混合发酵的酸乳口感和风味更佳。酸奶发酵基本原理是通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸。乳酸使牛奶中酪蛋白（约占全乳的2.9%，占乳蛋白的85%）变性凝固而是整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可形成酸奶特有的香味和风味。因此单菌发酵的酸乳口感比较单一，乳酸菌混合发酵的酸乳口感则比较丰富并且风味更佳。
一、实验目的
1.掌握培养基的配制方法和高压蒸汽灭菌锅的使用方法。
2.掌握菌种的分离纯化方法。
3.了解乳酸菌的生长特征。
4.学会制作乳酸菌饮料的方法。
二、实验内容
乳酸菌的分离纯化
1．无菌操作倒平板、十倍稀释、划线分离，恒温培养
2．菌落观察与镜检
3．筛选生产用菌株
优化酸奶制作条件
.菌落形态观察：乳白色 边缘不整齐，稍呈半球状凸起，实心菌落。
个体形态：半透明 细杆状 链状排列，大量时呈发丝状堆积。初步认为乳杆菌。
2）配制脱脂乳试管培养基，分装试管，包扎，灭菌备用。
脱脂乳试管培养基成分：20g脱脂奶粉，285ml灭菌水。
配制好的脱脂乳培养基分装到15支试管中。
（3）选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，40℃培养箱中培养8～24h。若牛乳出现凝固，无汽泡，呈酸性，涂片镜检细胞为杆状或链球状（两种形状的菌种分别选入），革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代4～6次，最终选择出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌种待用（革兰氏染色方法）
乳酸菌的分离与纯化
乳酸菌的分离与纯化及土豆（大豆）发酵1．乳酸菌的种类、形态、生理生化特征乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。
大多数不运动，少数以周毛运动。
菌体常排列成链。
在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵，而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO２等物质的称为异型乳酸发酵。
有微好氧菌和专性厌氧菌。
根据细胞形态为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌族（Strepto coccea e）和乳酸杆菌（Lactoba cillea e）。
乳酸链球菌族，菌体球状，通常成对或成链，在固体培养基上菌落较小，生长缓慢。
多数为同型发酵，如链球菌属（Strepto coccus），是与人类关系密切的重要菌群，有些菌是人和温血动物的致病菌；有些是人体的正常菌群存在于口腔和肠道；有些是乳制品及植物发酵食品中的常用菌，常在食品工业中使用，如乳链球菌（S．lactis）。
少数为异型发酵，如肠膜状明串珠菌（Leucono stocme senter oides）是制药工业上生产右旋糖酐（即代血浆）的重要菌种，但也是制糖工业的一种害菌，常使糖汁发粘稠而无法加工。
乳酸杆菌族，菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分枝。
在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。
乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。
2.实验材料2.1试验设备天平1个、牛角匙、电炉1个、 pH试纸（1套）、 100ml量筒（2个）、漏斗、漏斗架（1套）、玻璃棒（2根）、棉塞、培养基（15个）、无菌移液管（3支）、牛皮纸（5张）、线绳、标签、 500mL锥形瓶3个、 250mL锥形瓶2个、试管20只、 500mL烧杯2个、 250mL烧杯2个、 100mL烧杯2个、酒精灯2个、石棉网1个、接种针（环）2个。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酸奶中乳酸菌的分离与纯化
一、实验目的
1.掌握分离乳酸菌的基本原理和操作技术；
2.学习并掌握稀释法和微生物纯培养操作。
二、实验设备及材料
培养基材料：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、溴甲酚绿、琼脂。
实验材料：无菌水、培养皿、电热套、高压蒸汽灭菌锅、电子分析天平、涂布棒、酒精灯、无菌试管、移液枪、无菌吸管。
三、实验原理
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。
大多数不运动，少数以周毛运动。
菌体常排列成链。
根据细胞形态分为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌和乳酸杆菌。
在乳酸菌培养基平板上，乳酸菌菌落大约1～3mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸周围还能产生CaCO3溶解圈。
乳酸菌革兰氏染色后呈蓝色，为革兰氏阳性菌。
四、实验步骤
1.乳酸菌培养基的制作
配方
蛋白胨 2.0g
酵母膏 2.0g
番茄汁40g
葡萄糖 2.0g
吐温0.10mL
碳酸钙 3.4g
溴甲酚绿0.02g
琼脂2～4g
水200mL
①称量：按照培养基配方依次称取药品放入烧杯中。
②熔化：在烧杯中加入略少于200mL水，加热至沸腾。
依次加
入药品，用玻璃棒不断搅拌，待其完全溶解后，加入琼脂，搅拌至完全熔化，最后补足所损失的水分。
③分装：将配置的乳酸菌培养基装入三角瓶中。
④加棉塞、包扎
⑤灭菌：将乳酸菌培养基在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭
菌20min。
⑥无菌检查
2.倒平板
将乳酸菌培养基熔化，待冷却至55～60℃时，倒平板，倒好后，在室温下培养2～3d，或37℃培养24h，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。
3.制备稀释液
量取酸奶10mL，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震摇约20min，使酸奶与无菌水充分混合，将酸奶分散。
用一只1 mL无菌吸管从中吸取1 mL酸奶悬浊液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。
然后再用一支1 mL无菌吸管从此试管中吸取1 mL注入另一盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成10−3、10−4、10−5各种稀释度的酸奶稀释液。
4.涂布
将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10−3、10−4、10−5三种稀释度，然后用三支1mL无菌吸管分别由10−3、10−4、10−5三管酸奶稀释液中吸取0.2mL对号放入写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂布棒轻轻地涂布均匀。
5.培养
将接种后的平板后倒置于37℃培养3～5 d。
6.纯化
待菌落长出后，选中目标菌落。
用接种钩或无菌牙签挑取菌落边缘，并移植于新的乳酸菌培养基。
注意每一个平皿只能用于纯化1个菌。
将重新接种后的平皿置于37℃环境下培养3～5d。
然后，用显微
镜检查菌落是否单纯，若有其他菌混杂，就要再进行一次分离、纯化，直到获得纯培养。
7.保藏
将分离到的目标菌接种于乳酸菌培养基斜面上，37℃培养至斜面长满。
然后保存至4℃冰箱备用。