动物固体组织蛋白提取-.

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细胞蛋白提取方法4页

细胞蛋白提取方法4页

细胞蛋白提取方法4页细胞蛋白提取是生物学研究中的一个重要步骤,可用于分离纯化目标蛋白质、检测蛋白质表达水平、研究蛋白质功能等。

本文将介绍四种常见的细胞蛋白提取方法,并分析它们的优缺点。

一、化学法化学法是最早使用的一种细胞蛋白提取方法。

其基本思路是将细胞破碎后,借助化学性质将蛋白质从细胞质中萃取出来。

1.酸性抽提法酸性抽提法最早用于提取细菌蛋白,后来逐渐应用于动物和植物细胞中,适用于水溶性蛋白。

操作时,将细胞用冷酸淀粉液破碎,使核酸和金属离子与蛋白质结合,然后用盐酸或硫酸调酸至pH3.5-4.0,离心沉淀细胞碎片,收集上清液并加入饱和的氨烷或三甲基乙酸酯,离心沉淀,洗涤并重悬。

优点:操作简单,适用于小规模提取。

缺点:易造成蛋白质的氨基酸脱羧、失活以及相互聚集等。

2.酒精沉淀法酒精沉淀法是利用酒精沉淀蛋白来提取细胞蛋白。

操作时,将细胞破碎,用氯化钠等盐类调节细胞液的离子强度,加入80%酒精沉淀蛋白质,沉淀后用70%酒精洗涤,除去脂肪和亲水性蛋白,最后重悬。

优点:适用于固体细胞组织和肌肉等纤维化组织,可提取胞外基质蛋白。

缺点:蛋白质失活易,不能提取不稳定蛋白质。

二、物理法物理法是利用物理力学原理将细胞破碎并萃取蛋白质。

这种方法适用于大量细胞的破碎和蛋白质的快速提取。

1.高压均质法高压均质法是传统的细胞蛋白提取方法。

操作时,将细胞悬液通入高压均质器,使之经过高压作用下击碎,高速剪切和磨擦等力作用,使细胞膜和核膜破裂,细胞内蛋白质释放出来。

优点:破碎效率高,提取速度快。

2.超声波破碎法超声波破碎法是近年来出现的一种物理法。

操作时,利用声波振动作用于细胞,使其中的蛋白质破碎并散布入溶液中。

优点:破碎效率高,可以提取水溶性和非水溶性蛋白,对蛋白质保护较好,适用于活性蛋白的提取。

缺点:超声波会产生热量和产生气泡,容易导致蛋白失活和降解,需要控制时间和频率。

三、生物法生物法是利用生物学原理将细胞破碎并清除细胞碎片。

高脂肪样本蛋白提取方法

高脂肪样本蛋白提取方法
本试剂盒提取的蛋白不可用于 2D 电泳。如下游实验需要用于 2D 电泳,请使用货号 BB-3181 的试剂盒。
使用方法:
细胞蛋白提取: 1. 提取液制备:每 500ul 冷的蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物混匀后 置冰上备用。 2. 取 5-10×106 个细胞①,在 4℃,1000rpm 条件下离心 5-10 分钟,小心吸取培养 基,尽可能吸干,收集细胞。 3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 每 5×106 个细胞中加入 500ul 冷的蛋白提取液,混匀后,在 4℃条件下振荡 15-20 分钟。 5. 在 4℃,14000rpm 条件下离心 15 分钟。 6. 将含有脂肪的上清吸入蛋白离心管中,套上液体收集管,在 4℃,12000rpm 条 件下离心 5 分钟。 7. 将液体收集管中的液体吸入另一预冷的干净离心管,即可得到蛋白样品。 8. 将蛋白离心管中的脂肪杂质用吸头或合适工具刮出,即可用于处理上步未处理
完的样品或其他待处理样品。 9. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
组织蛋白提取: 1. 提取液制备:每 500ul 冷的总蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物,混 匀后置冰上备用。 2. 取 100mg 组织样本剪碎,加入蛋白提取液,用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼 可见固体①。 3. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中,在 4℃,10000rpm 条件下离心 5 分钟。 4. 将含有脂肪的上清吸入蛋白离心管中,套上液体收集管,在 4℃,12000rpm 条 件下离心 5 分钟。 5. 将液体收集管中的液体吸入另一预冷的干净离心管,即可得到蛋白样品。 6. 将蛋白离心管中的脂肪杂质用吸头或合适工具刮出,即可用于处理上步未处理 完的样品或其他待处理样品。 7. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。

胶原蛋白的制作流程

胶原蛋白的制作流程

胶原蛋白的制作流程胶原蛋白(Collagen)是一种重要的结构蛋白质,存在于动物组织中,具有构建和维持组织结构的功能。

胶原蛋白的制作流程一般包括以下几个主要步骤:1.原料收集和处理:胶原蛋白的原料一般来自动物组织,如牛皮、鱼鳞等。

首先需要收集原料并进行清洁和处理,以去除杂质和污染。

2.浸泡和提取:经过处理的原料通常会被浸泡在适当浓度的酸性溶液中,以便提取胶原蛋白。

酸性条件有助于胶原蛋白的溶解和分离,并且可以去除其他非胶原蛋白质的组织成分。

3.脱色和净化:提取的溶液中通常会含有一些杂质,如色素和脂肪等。

为了使胶原蛋白的纯度更高,需要进行脱色和净化步骤。

脱色可以通过将溶液暴露在氧气或过氧化氢中来实现。

净化过程一般包括过滤、离心、浓缩和冷冻等步骤。

4.酸解和去除杂质:胶原蛋白的提取通常包括将其酸解(如使用酸性水解酶或酸性溶液),以分解较高分子量的胶原链并减少其粘度。

酸解的条件需要得当,以避免对胶原蛋白的结构和性质造成不可修复的损伤。

之后,通过中和和洗涤等步骤,去除酸性溶液和杂质,以获得相对纯净的溶液。

5.过滤和浓缩:通过使用适当的膜过滤器,对溶液进行过滤,以去除残余的固体颗粒和大分子物质。

接下来,可以通过浓缩胶原蛋白溶液,以便将其浓度提高到所需的水平。

6.杀菌和灭活:为了确保制备的胶原蛋白溶液具有良好的微生物安全性,通常会进行杀菌和灭活处理。

这可以通过加热、紫外线辐射或化学物质来实现,以摧毁或抑制潜在的微生物污染。

7.冷冻干燥和包装:将制备好的胶原蛋白溶液进行冷冻干燥(冻干)处理,以便减少水分含量,并使其更加稳定和易于储存。

冷冻干燥通常使用专用的设备和工艺进行。

最后,将冷冻干燥的胶原蛋白粉末包装并密封,以保护其品质和稳定性。

总结起来,胶原蛋白的制作流程包括原料处理、浸泡和提取、脱色和净化、酸解和去除杂质、过滤和浓缩、杀菌和灭活,最后进行冷冻干燥和包装。

这些步骤在制备过程中都需要严格的操作和控制,以确保制备得到具有高纯度和优良性质的胶原蛋白产品。

软骨蛋白提取步骤

软骨蛋白提取步骤

软骨蛋白提取步骤软骨蛋白提取是一种常用的实验方法,用于从软骨中提取蛋白质。

软骨是一种坚韧的结缔组织,主要由软骨细胞和软骨基质组成。

软骨蛋白是软骨基质中的主要成分,具有重要的生物学功能。

本文将详细介绍软骨蛋白提取的步骤及相关实验注意事项。

实验材料准备在进行软骨蛋白提取实验之前,需要准备以下实验材料:1.软骨样本:可以使用动物软骨(如小鼠、大鼠等)或人类软骨(如关节软骨、鼻软骨等)作为实验样本。

软骨样本应新鲜,保存在-80摄氏度的冰箱中。

2.细胞裂解缓冲液:根据实验需要选择合适的细胞裂解缓冲液,常用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液(PBS)、甘氨酸盐缓冲液(Tris-HCl)等。

3.细胞裂解酶:根据实验需要选择适合的细胞裂解酶,常用的酶有蛋白酶、核酸酶等。

4.蛋白质抽提试剂盒:根据实验需要选择适合的蛋白质抽提试剂盒,常用的试剂盒有RIPA缓冲液、细胞裂解液等。

5.离心管、离心机:用于离心样本以分离蛋白质。

6.电泳试剂:进行蛋白质分析时需要准备电泳试剂,包括凝胶、缓冲液、染色剂等。

实验步骤软骨蛋白提取的步骤主要包括软骨样本的处理、细胞裂解、蛋白质抽提和蛋白质分析等。

下面将详细介绍每个步骤的操作方法。

1.软骨样本的处理–将冰冻的软骨样本取出,放置在冰盒中解冻。

–使用去离子水或PBS缓冲液清洗软骨样本,去除表面的杂质。

–将软骨样本切割成小块,使其容易裂解和抽提蛋白质。

2.细胞裂解–将切割好的软骨样本置于细胞裂解缓冲液中,加入适量的细胞裂解酶。

–使用超声波仪器或研钵和研针进行细胞裂解,直至软骨样本完全裂解。

–将裂解后的混合液放置在冰上,以保持低温。

3.蛋白质抽提–使用离心机将裂解后的混合液进行离心,以去除细胞碎片和细胞核等固体颗粒。

–取出上清液,加入蛋白质抽提试剂盒中提供的试剂,按照试剂盒说明书进行蛋白质抽提。

–使用离心机将抽提后的蛋白质样品进行离心,以去除残留的固体颗粒。

4.蛋白质分析–取出蛋白质样品,使用比色法或Western blot等方法进行蛋白质浓度的测定。

小鼠中提collagen i蛋白方法-概述说明以及解释

小鼠中提collagen i蛋白方法-概述说明以及解释

小鼠中提collagen i蛋白方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述Collagen I是一种重要的结构蛋白,广泛存在于动物体内的各种组织中,包括皮肤、骨骼、肌肉和血管等。

它不仅在维持组织的结构完整性和稳定性方面起到关键作用,还参与许多生物过程,如细胞迁移、细胞黏附和组织修复等。

因此,对Collagen I的研究具有重要的理论和应用价值。

目前,提取和纯化Collagen I蛋白的方法有很多种,但由于其在细胞外基质中的高丰度和结构上的复杂性,这些方法往往具有一定的复杂性和挑战性。

本文将重点介绍一种利用小鼠作为研究模型,成功提取和纯化小鼠中的Collagen I蛋白的方法。

本文将首先介绍提取小鼠中Collagen I蛋白的方法。

这涉及到从小鼠组织中获取Collagen I蛋白的样品,并对其进行初步的处理和纯化。

接下来,我们将详细介绍分离和纯化Collagen I蛋白的步骤。

这些步骤将包括多级的色谱层析和电泳技术,以确保最终获得高纯度的Collagen I蛋白样品。

通过采用上述方法,我们成功地提取和纯化了小鼠中的Collagen I蛋白,并经过进一步的分析和鉴定证实了其纯度和结构的正确性。

这一研究成果将有助于我们更深入地了解Collagen I蛋白的功能和作用机制,为相关疾病的治疗和组织工程领域的应用提供重要的基础。

综上所述,本文将介绍一种成功提取和纯化小鼠中Collagen I蛋白的方法。

通过这一方法,我们将为进一步的研究和应用提供有力的支持,推动Collagen I蛋白领域的深入发展。

1.2文章结构1.2 文章结构本文主要包括引言、正文和结论三个部分。

引言部分将概述研究背景和意义,介绍小鼠中Collagen I蛋白的研究现状,并指出本文的研究目的。

正文部分将分为两个主要方法进行阐述。

首先,方法一将详细介绍如何从小鼠身体中提取Collagen I蛋白,包括所需试剂和操作步骤等内容。

其次,方法二将详细介绍如何对提取的Collagen I蛋白进行分离和纯化的过程,包括采用的分离技术和纯化方法等。

检测两种蛋白质之间相互作用

检测两种蛋白质之间相互作用

检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较1。

生化方法●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法。

改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行,可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。

缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。

另外灵敏度不如亲与色谱高、●Far-Western又叫做亲与印记、将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用,最后显影。

缺点就是转膜前需要将蛋白复性。

2. 等离子表面共振技术(Surface plasmon resonance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面、当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用,那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升,从而导致共振角度得改变。

而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。

该技术不需要标记物与染料,安全灵敏快速,还可定量分析。

缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。

ﻫ3、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成。

分别使结合域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白,在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因。

缺点:自身有转录功能得蛋白会造成假阳性、融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。

不利于核外蛋白研究,会导致假隐性。

ﻫ5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近(〈100埃)时,它们之间可发生能量转移得现象、荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。

它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。

蛋白冻干粉的制备

蛋白冻干粉的制备

蛋白冻干粉的制备随着医学和生物技术的迅速发展,蛋白质制品在生产和研发中扮演着越来越重要的角色。

蛋白冻干粉是其中一种重要的蛋白质制品,可以为各个领域的研究和应用提供有效的支持。

蛋白冻干粉制备的过程涉及到多个环节,由此可以分为以下几部分:一、蛋白质提取蛋白质提取是蛋白质冻干粉制备的首要环节。

蛋白质的来源可以是动物组织、植物组织或微生物等。

其中,动物组织蛋白的提取主要经过以下步骤:组织细胞破碎,去除细胞壁和细胞膜,沉淀蛋白质并进行粗提,通过酸碱或趋近电泳等方法进行纯化。

对于植物工程和微生物工程等领域的蛋白质提取过程,也会有相应的差异。

二、溶解和稳定剂添加蛋白质粗提后,需要进行溶解和稳定剂添加的工艺处理。

通常情况下,蛋白溶液需要加入一定浓度的缓冲液,以稳定蛋白质的三维结构,并防止蛋白质的降解、氧化和变性。

此外,还需要加入一定浓度的凝聚抑制剂和表面活性剂等,以帮助蛋白质在制备过程中不发生聚集、析出或降解等现象。

三、通量和冷冻干燥通量和冷冻干燥是蛋白冻干粉制备过程中的关键环节。

干燥的速度必须控制良好,以防止高热对蛋白质结构的损伤。

因此,在干燥的过程中,需要对各个阶段的温度、压力、通量和速度等参数进行严密的控制和监测,以确保最终的蛋白冻干粉质量。

四、粉末包装和储存蛋白冻干粉需要通过特定的包装方式和方法进行储存,以确保其质量和稳定性。

包装通常采用保护性包装材料,如铝袋、塑料容器或玻璃瓶。

包装完成后,蛋白冻干粉需要在特定的环境下存放,包括在真空下、低温、干燥或无菌环境下存放,以确保蛋白冻干粉的长期储存和使用安全。

以牛胚胎激素为例,其制备流程如下:1.收集牛卵巢组织并剪成小块,用PBS缓冲液洗涤去除残留的血液;2.加入含有2%蛋白酶K的PBS缓冲液,用无菌细胞均质器破碎组织细胞,并过滤去掉固体残留物;3.将牛胚胎激素溶解于PBS缓冲液中,加入PEG和Tween-20的混合物用于稳定,将混合物过滤并进一步澄清;4.将溶液分装至冻干板上,并放入真空干燥箱中,实施冷冻干燥处理;5.冷冻干燥完成后,使用包装袋将冻干制品包装,并进行长期储存或运输。

检测两种蛋白质之间相互作用

检测两种蛋白质之间相互作用

检测两种蛋⽩质之间相互作⽤检测两种蛋⽩质之间相互作⽤的实验⽅法⽐较1. ⽣化⽅法●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专⼀性作⽤为基础的⽤于研究蛋⽩质相互作⽤的经典⽅法。

改法的优点是蛋⽩处于天然状态,蛋⽩的相互作⽤可以在天然状态下进⾏,可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作⽤的蛋⽩复合体。

缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋⽩复合物时候为直接相互作⽤的两种蛋⽩。

另外灵敏度不如亲和⾊谱⾼。

●Far-Western⼜叫做亲和印记。

将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋⽩能与标记了同位素的诱饵蛋⽩发⽣作⽤,最后显影。

缺点是转膜前需要将蛋⽩复性。

2. 等离⼦表⾯共振技术(Surface plasmon resonance)该技术是将诱饵蛋⽩结合于葡聚糖表⾯,葡聚糖层固定于⼏⼗纳⽶厚的技术膜表⾯。

当有蛋⽩质混合物经过时,如果有蛋⽩质同“诱饵”蛋⽩发⽣相互作⽤,那么两者的结合将使⾦属膜表⾯的折射率上升,从⽽导致共振⾓度的改变。

⽽共振⾓度的改变与该处的蛋⽩质浓度成线性关系,由此可以检测蛋⽩质之间的相互作⽤。

该技术不需要标记物和染料,安全灵敏快速,还可定量分析。

缺点:需要专门的等离⼦表⾯共振检测仪器。

3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因⼦的结构特殊性,这些转录因⼦通常需要两个或以上相互独⽴的结构域组成。

分别使结合域和激活域同诱饵蛋⽩和猎物蛋⽩形成融合蛋⽩,在真核细胞中表达,如果两种蛋⽩可以发⽣相互作⽤,则可使结合域和激活域在空间上充分接近,从⽽激活报告基因。

缺点:⾃⾝有转录功能的蛋⽩会造成假阳性。

融合蛋⽩会影响蛋⽩的真实结构和功能。

不利于核外蛋⽩研究,会导致假隐性。

5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法⾊基团在⾜够近(<100埃)时,它们之间可发⽣能量转移的现象。

荧光共振能量转移技术可以研究分⼦内部对某些刺激发⽣的构象变化,也能研究分⼦间的相互作⽤。

它可以在活体中检测,⾮常灵敏,分辩率⾼,能够检测⼤分⼦的构象变化,能够定性定量的检测相互作⽤的强度。

课件:实验八 动物组织中DNA的提取

课件:实验八 动物组织中DNA的提取

分离到的脱氧核糖核蛋白,用十二烷 基硫酸钠(SDS)使蛋白质变性,让DNA 游离出来,再用氯仿-异戊醇混和试剂沉 淀除去变性的蛋白质。然后加入95%乙 醇,可将DNA沉淀析出。
为了防止DNA酶解,在提取过程中加柠檬 酸盐、EDTA盐并要求在40C以下进行,以抑 制DNA酶的活性。
三、实验试剂及器材
1. 称取动物肝脏10g,剪碎后加入预冷的 0.15mol/LNaCl-0.015mol/L,pH7.0柠檬酸 钠溶液10ml,在组织捣碎机中捣成匀浆。
2. 4℃,6000rpm,离心15min,弃上清。
3. 沉淀中加入2倍体积的冷0.15mol/LNaCl0.015mol/L,pH7.0柠檬酸钠溶液,搅匀, 4℃, 6000rpm,离心15min,弃上清。
1. 0.15mol/LNaCl-0.015mol/L,pH7.0柠檬酸钠溶液 2. 0.15mol/LNaCl-0.1mol/L, EDTANa2溶液 3. 5%SDS溶液 4. 氯仿-异戊醇溶液:氯仿:异戊醇=24:1 5. 95%乙醇 6. 固体氯化钠 6. 组织捣碎机 7. 冷冻离心机
四、实验操作
动物生物化学实验
实验八 动物组织中DNA的提取
一、实验目的
• 1.学习从动物组织细胞中提取DNA的基本原理。 • 2. 掌握提白质结合成
脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白而存在。这两
种核蛋白在不同浓度的盐溶液中,有不同的 溶解度。在稀盐溶液(0.15mol/L)中,核糖 核蛋白溶解度大,脱氧核糖核蛋白溶解度小; 而在高盐溶液中( 1mol/L)中,脱氧核糖核 蛋白溶解度大,核糖核蛋白溶解度小。利用 此差异,可见两种核蛋白彼此分开。
7. 将此溶液约4ml倒入离心管中,加入等体积的
氯仿-异戊醇,剧烈振荡10分钟,离心5分钟,可 见离心液分为三层:上层为清液,中层变性蛋白, 下层氯仿-异戊醇。

蛋白质的提取、分离纯化及定量

蛋白质的提取、分离纯化及定量

实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。

2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。

实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

层析溶剂由有机溶剂和水组成,滤纸和水的亲和力强,与有机溶剂的亲和和弱,因此在展层时,水是固定相,有机溶剂是流动相。

将样品点在滤纸上〔原点〕,进展展层,样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配,由于它们的分配系数不同,不同AA随流动相移动速率就不同,于是将这些AA别离开来,形成距原点距离不等的层析点。

溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变,*种物质的Rf值是常数。

可根据R f 作为定性依据。

Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

样品中如有多种AA,其中有些AA的Rf值一样或相近,此时只用一种溶剂展层,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,将滤纸转90度再用另一种溶剂展层,从而到达别离的目的,这种方法叫双向层析。

仪器、试剂1、扩展剂:是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4:1进展混合得混合液。

将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中,与15 ml水混合,充分振荡,静置后分层,放出下层水层,漏斗内即为扩展剂。

取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂,其余的倒入培养皿中备用。

2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸:5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸:各5 ml混合。

3、显色剂:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂:用量筒量取约5 ml平衡溶剂,放入培养皿中,然后置于密闭的层析缸中。

2.准备滤纸:取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。

在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线,在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total—RNA。

2、设计蛋白表达引物.引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA。

4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。

表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。

7、蛋白的诱导表达。

1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0。

6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。

37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。

甘油是用0。

22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%—60%,使用时自己计算用量.4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意:1。

如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达.葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。

2。

保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。

8、包涵体检测。

方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌.1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD〉=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌.2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。

)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

动物固体组织蛋白提取_Protocol

动物固体组织蛋白提取_Protocol

动物固体组织蛋白提取 Protocol1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。

早晨取出磁珠和匀浆管,自然晾干;也可放入烤箱中,速度较快。

2、 裂解液配制:RIPA :PMSF=100:1,现配现用。

(1000ulRIPA+10ulPMSF )。

置入4℃冰上。

3、抽蛋白(应冰上进行):a 、适量组织(最好放入液氮中反复研磨成粉状)加入裂解液中。

一般10ml 管体系中加入:7-8粒磁珠、100mg 组织、1mlRIPA+10ulPMSF 、1 tablet Cocktail 。

b 、匀浆。

手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8分钟),充分研碎,使组织匀浆化。

机器匀浆:用组织捣碎机10000~15000r/min 上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10秒/次,间隙30秒,连续3~5次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

超声粉碎:用超声粉碎机进行粉碎,可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用40安培,5秒/次,间隙10秒反复3~5次。

反复冻融:培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆,也可以反复冻溶3次左右(即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰,溶解,再结冰,再溶解,反复3次左右),但有部分酶活力会受影响。

c 、将组织匀浆转入1.5ml 的EP 管中(eppendorf 管、离心管)。

12000r/min 4°C 离心15min 。

d 、离心后EP 管中液体分三层,提取中间无色液相,移入新的EP 管中。

可-80℃保存。

4、蛋白浓度测定。

a 、配工作液:溶液A :溶液B=50:1(200ul :4ul )。

蛋白质分离纯化的一般程序

蛋白质分离纯化的一般程序

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:(一)材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。

所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。

常用的破碎组织细胞的方法有:1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。

常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。

这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。

抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。

如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。

在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。

(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。

比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

常用的有下列几种方法:1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。

被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。

能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。

此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。

由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。

蛋白质分离策略

蛋白质分离策略

蛋白质分离方法摘要:本文介绍了蛋白质分离的一系列方法。

浸提,超声波破碎,研磨等原料预处理方法。

蛋白质粗提纯中的盐析,透析,超滤等方法。

层析法中的离子交换层析,凝胶层析,亲和层析用于蛋白质初提纯。

精提纯主要是使用电泳技术,如等电聚焦,DSD-PAGE,毛细管电泳,以及高效液相色谱法。

一、原料的预处理在对蛋白质分离前,首先要对所要分离的原料进行分析。

要根据分离纯化原料不同而采取不同的预处理方法。

如果是富蛋白,或者液体原料,如血清,蛋清,蛇毒,蝎毒等,无需进行原料预处理,直接进行蛋白质的粗提取和富集;如果是动物材料,如肉,表皮等,要去掉结缔和脂肪组织;对于植物组织和细菌要将细胞壁进行破壁处理。

对原料的预处理不仅要把蛋白质从原来组织中释放出来,而且要保持蛋白质原有的天然状态。

为了防止蛋白质变性,溶解蛋白质的溶液一般为蛋白质缓冲溶液,缓冲溶液主要有,NaAc-HAc[1]溶液,PBS-NaCl[2][3],NaH2PO4-Na2HPO4[4]缓冲溶液,Tris-HCI缓冲溶液[5],缓冲溶液不仅可以保持蛋白质活性,还可以作为浸提液提取蛋白质。

预处理的主要方法有浸提法,超声破碎法、研磨法、高压挤压法以及酶处理法[6]。

1.1浸提法浸提是最常用的一种溶解蛋白质的方法,主要原理是利用蛋白质在溶液中具有一定溶解度,溶解于溶液中,达到蛋白质与原料(通常是固体)的分离。

浸提液主要有,水,去离子水或超纯水,提取水溶性蛋白质;盐,一般是NaCl,提取盐溶性蛋白质:醇,如乙酸[7],正丙醇,提取醇溶蛋白;弱酸,如乙酸[8],弱酸性缓冲溶液,如PH6.0 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液,提取弱酸溶性蛋白质;弱碱,主要是碱NaOH[9]或弱碱性缓冲溶液,如PH8.5KH2PO4-Na2HPO4[10],缓冲溶液,提取弱碱溶性蛋白质。

其他浸提液,如1.0mol/L盐酸胍与含有0.02%EDTA的MES溶液浸提鲨鱼软骨[11]。

组蛋白提取方法

组蛋白提取方法

2012
(IF=3.322)
● Pin Huan et al.
Comparative proteomic analysis of challenged Zhikong scallop (Chlamys
farreri): A new insight into the anti-Vibrio immune response of marine bivalves
pregnancy villous EVT's invasion function
Virology Journal
2011, 8:114
(IF=2.55)
● Weiwei Jianga, Bin Lia et al.
Artesunate in combination with oxacillin protect sepsis model mice challenged with lethal live
提取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白质电泳、组蛋白修饰实验比如乙酰化、甲 基化、sumoylation 试剂和仪器
● 移液器、吸头
● 离心机及离心管
● 涡旋振荡器
● 冰箱,冰盒
使用方法:
细胞总蛋白提取: 1. 提取液制备:每 500ul 冷的总蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物和 2ul 磷酸酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。 2. 取 5-10×106 个细胞①,在 4℃,1000rpm 条件下离心 5-10 分钟,小心吸取培养 基,尽可能吸干,收集细胞。 3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 每 5×106 个细胞中加入 500ul 冷的总蛋白提取液,混匀后,在 4℃条件下振荡 15-20 分钟。 5. 在 4℃,14000rpm 条件下离心 15 分钟。

细胞和动物组织核蛋白的提取方法

细胞和动物组织核蛋白的提取方法

细胞和动物组织核蛋白的提取方法产品组成 310001 310002规格 50 assays 100 assaysBuffer A (Cytoplasmic Extraction Reagent) 10ml 20mlBuffer B (Nuclear Extraction Reagent) 10ml 20ml蛋白酶抑制剂混合物 250ul 500ul使用方法:A.细胞蛋白提取1. 取5-10×106个细胞,在4℃,500×g条件下离心2-3分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集细胞。

2. 用冷PBS洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。

3. 每20ul细胞压积中加入200μl冷的Buffer A,2ul蛋白酶抑制剂混合物,高速涡旋振荡15秒,置冰上10分钟。

4. 再次高速涡旋振荡5秒,然后在4℃,16000×g条件下离心5分钟。

5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到胞浆蛋白,请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。

6. 在沉淀中加入200μl冷的Buffer B,2ul蛋白酶抑制剂混合物,高速涡旋振荡15秒。

7. 置冰上40分钟,每隔10分钟高速涡旋振荡15秒。

8. 在4℃,16000×g条件下离心10分钟。

9. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到核蛋白。

B.组织蛋白提取1. 取适量组织样本剪碎,加冷PBS,用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体(或用液氮研磨),冰上静置5分钟,小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。

2. 在4℃,500×g条件下离心2-3分钟,弃上清。

3. 按照细胞蛋白的提取方法的第3步骤往下操作即可。

上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用。

注意事项:1. 实验过程中的所有BestBio-贝博生物试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。

2. 整个过程须保持样品处于低温状态。

储存条件:-20℃保存。

有效期:一年。

全蛋白抽提试剂盒

全蛋白抽提试剂盒

凯基全蛋白提取试剂盒Cat Number:For Research Use OnlyStore at 4℃ for one yearExpire date:一、 试剂盒说明本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白, 用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer匀浆裂解组织或细胞,作用温和,提取过程简便高效。

获得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后续研究,但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究,因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂。

二、 试剂盒组份组份 KGP250 (50 tests) KGP2100(100 tests)储存温度 Lysis Buffer 50 mL 100 mL 4℃磷酸酶抑制剂 250 μL 500μL -20℃蛋白酶抑制剂 50 μL 100 μL -20℃PMSF(100mM)500 μL 1000 μL -20℃L三、 操作步骤Ⅰ 实体组织蛋白的提取1. 在每1mL 冷Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制剂, 1 μL蛋白酶抑制剂和 5μL 100mM PMSF,混匀。

冰上保存数分钟待用。

2. 每100mg固体组织置于培养皿中,手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块,加入0.5~1 mL冷 Lysis Buffer,玻璃匀浆器上下手动匀浆15次,注意低温操作;3. 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管,离心10000转/分,4℃离心5 min;4. 取上清转移至新的预冷的离心管中,即为全蛋白提取物,蛋白定量(Bradford法、BCA法);5. 分装保存于-70℃,避免反复冻融。

Ⅱ 培养细胞蛋白提取1. 贴壁培养的细胞,吸去培养基后,加入10mL/150mm培养板的冷PBS洗两次,每次振摇数次以尽量去除培养液;2. 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞,将细胞及培养液移至离心管中, 1000转/分离心10 min,再用10mL/150mm培养板的冷PBS,1000转/分离心5 min洗两次;3. 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入5μL磷酸酶抑制剂, 1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF,混匀。

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动物固体组织蛋白提取-Protocol2017-07-18动物固体组织蛋白提取 Protocol1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。

早晨取出磁珠和匀浆管,自然晾干;也可放入烤箱中,速度较快。

2、裂解液配制:RIPA:PMSF=100:1,现配现用。

(1000ulRIPA+10ulPMSF)。

置入4℃冰上。

3、抽蛋白(应冰上进行):a、适量组织(最好放入液氮中反复研磨成粉状)加入裂解液中。

一般10ml管体系中加入:7-8粒磁珠、100mg组织、1mlRIPA+10ulPMSF、1 tablet Cocktail。

b、匀浆。

手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8分钟),充分研碎,使组织匀浆化。

机器匀浆:用组织捣碎机10000~15000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10秒/次,间隙30秒,连续3~5次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

超声粉碎:用超声粉碎机进行粉碎,可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用40安培,5秒/次,间隙10秒反复3~5次。

反复冻融:培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆,也可以反复冻溶3次左右(即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰,溶解,再结冰,再溶解,反复3次左右),但有部分酶活力会受影响。

c、将组织匀浆转入1.5ml的EP管中(eppendorf 管、离心管)。

12000r/min 4°C 离心15min。

d、离心后EP管中液体分三层,提取中间无色液相,移入新的EP管中。

可-80℃保存。

4、蛋白浓度测定。

a、配工作液:溶液A:溶液B=50:1(200ul:4ul)。

需测试复孔。

标本X,则需A量=2*(X+1+1)*200;B=2*(X+1+1)*4。

c、复孔,取蛋白6ul加入0.6mlEP管,再加入54ulH2O,混匀。

即10倍稀释。

d、取20-25ul 10倍稀释蛋白样本加入96孔板平底板内,再加入200ulAB工作液,混匀振荡后,37℃ incubate 30min。

注:应现加蛋白样本,再加工作液。

因为每次加蛋白后需换tip,再加入工作液即起反应,应缩短时间。

e、酶标仪检测562nm吸光度。

Programf、计算蛋白浓度。

根据标准曲线,如 Y=1.2745X-0.1684 其中Y:蛋白浓度;X:吸光度。

最终蛋白浓度为:10*Y(ug/ul、mg/ml) g、蛋白样本放-80℃冻存。

大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。

在典型的蛋白测定中,化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化,这一变化可由分光光度计或酶标仪检测,并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。

博士德为大家提供两种蛋白测定手段,每种都有其独特的优点。

如果样品数量较多,可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。

当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素:缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。

Commassie法(Bradford法):原理:在酸性条件,蛋白质与考马斯染料G-250结合,颜色从棕色变为蓝色,在595nm处检测吸光值然后与标准曲线对比,即可计算出待测蛋白的浓度。

BCA法:原理:在碱性条件下,蛋白将Cu++还原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成紫色络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。

现对这两种方法进行比较:一、实验材料:细胞总蛋白提取试剂盒(AR0103) M231BCA蛋白定量试剂盒(AR0146)Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒(AR0145)二、操作步骤:Commassie法: 1.将BSA冻干标准品(10mg/支)用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml,1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。

2.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

3.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。

4.滴加200ul考马斯增强型试剂(溶液A)至每孔混匀并充分震荡30S 5.停止震荡,在室温孵育样品10min 6.在酶标仪中测量595nm时的吸光值。

7.绘制标准曲线,再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

BCA法:1.按50体积BCA试剂A加入1倍体积BCA试剂B配置适量BCA工作液,充分混匀。

2.将BSA冻干标准品(10mg/支)用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml,1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。

3.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

4.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。

5.滴加200ulBCA工作液至每孔混匀并充分震荡30S 6.停止震荡,在37度孵育样品30min 7.在酶标仪中测量562nm时的吸光值。

8.绘制标准曲线,再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

三、实验结果其中1到8为2000ug/ml,1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625的标准浓度的BSA蛋白,9为空白孔,样品1为8倍稀释M231总蛋白,样品2为32倍稀释M231总蛋白Commassie法:为了测试准确,应在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。

由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.4mg/mlCommassie法优点是:1.灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1ug。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的'颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

2.测定快速、简便,只需加一种试剂。

完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。

由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。

3.干扰物质少。

如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是:1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g―球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。

2. 仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1M的NaOH。

(如同0.1M的酸干扰Lowary 法一样)。

3. 标准曲线也有轻微的非线性,在0-1000ug/ml浓度范围内有较好线性。

因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

BCA法:由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.28mg/ml BCA法特点: 1. 灵敏度高,检测浓度下限达到25μg/ml,最小检测蛋白量达到0.5μg,待测样品体积为1-20μl 。

2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响,可以兼容样品中高达5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween 20,60,80。

3. 在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。

4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。

5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响:EDTA小于10mM。

DTT小于1mM巯基乙醇低于1mMBCA法和Commassie法各有优势,在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用,以消除定量的误差。

(Radio Immunoprecipitation Assay)RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。

RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。

RIPA使用方法对于培养细胞样品:1. 融解RIPA裂解液,混匀。

取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。

2. 对于贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)。

按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。

用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。

通常裂解液接触细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。

对于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。

按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。

再用手指轻弹以充分裂解细胞。

充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

如果细胞量较多,必需分装成50-100万细胞/管,然后再裂解。

裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。

对于组织样品:1. 把组织剪切成细小的碎片。

2. 融解RIPA裂解液,混匀。

取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。

3. 按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。

(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。

)4. 用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。

5. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

6. 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈vortex使样品裂解充分。

然后同样离心取上清,用于后续实验。

直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

注:RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。

该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。

在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。

如果检测一些常见的转录因子,例如NFκB、p53等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子。

各种RIPA的差别及用途蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全摘要:破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶,这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。

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