固定化酶制备方法研究进展_曹树祥

专论与综述 固定化酶制备方法研究进展

曹树祥　黎苇

(九江职业大学,九江332000)

摘要　对固定化酶的主要制备方法进行了系统的阐述,根据作者本人的试验经验对

目前应用和研究得较多的方法作了详细的说明,对所阐述的各种固定化酶的制备方

法的优缺点进行了比较。

关键词　固定化酶　吸附　包埋　共价键结合　肽键结合　交联

本世纪60年代,一项新的技术——固定化酶技术开始发展起来。最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来,成为不溶于水的酶的衍生物,称为“水不溶酶”或“固相酶”。后来发现,也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中。将酶置于超滤装置中时,高分子底物与酶被截留在超滤膜一侧,而反应物可以透过膜流出,在这种情况下,酶本身仍是可溶的,只不过被固定在一个很有限的空间内,因此用水不溶酶和固相酶的名称不恰当。1997年第1届国际酶工程会议正式建议采用“固定化酶”的名称。

从60年代起,固定化酶的研究迅速发展,固定化方法目前已超过200种以上。近来研究较多且应用最广的两种方法分别为卡拉胶聚糖包埋法和海藻酸钙凝胶包埋法。本文依据国内外有关文献及作者在这一领域的试验与体会就固定化酶的主要制备方法作简要介绍与评述。

1　固定化酶制备方法的分类

固定化酶的制备方法可分为如下几类:

(1)吸附法:物理吸附法、离子吸附法等。

(2)包埋法:聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法和微囊法等。

(3)共价键结合法:重氮化法、烷基化和芳基化法、戊二醛处理法、钛螯合法、硫醇-二硫化物互换反应法和四组分缩合反应法等。

(4)肽键结合法:酰基迭氮衍生物法、溴化氰活化的多糖法、碳酸纤维素衍生物法、马来酐衍生物法、异氰衍生物法和硫酰胺结合法等。

(5)交联法。

2　吸附法

2.1　物理吸附法[1]

使酶直接吸附在载体上的方法称为物理吸附法。常用的载体有:(1)有机载体,如面筋、淀粉等;(2)无机载体,如氧化铝、活性炭、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛等。用此法制成的固定化酶,活力损失少,但酶与载体的结合不牢固,易于脱落,很少有实用价值。

2.2　离子吸附法[1]

此法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体结合,酶吸附于载体上较为牢固。此法在工业上应用较广泛,常用的载体有:(1)阴离子交换剂,如二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类(ECTEOLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、IRA-410、IRA-900等;(2)阳离子交换剂,如羧甲基(CM)-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-120、IR-200、Dowex-50等。

1999-01-12收到初稿,1999-05-30收到修改稿。

3　包埋法

包埋法是将酶包埋于凝胶或其他聚合体格子内,这种结构可以防止酶渗出,但是底物能渗入格子内与酶相接触。此法的优点是适用范围广,许多种酶都可用此法固定,工艺简便,酶分子仅仅是被包埋起来,固定化过程中酶未参与化学反应,故可得到活力较高的固定化酶。但是,用此法制成的固定化酶,不能对大分子底物的生化反应起催化作用。

3.1　聚丙烯酰胺凝胶包埋法

此法是将含有游离酶的水溶液与丙烯酰胺溶液混合,在交联剂、引发剂等的作用下,丙烯酰胺聚合成凝胶,将酶包埋入凝胶格子,将所得凝胶作成颗粒,低温贮存或冷冻干燥成为粉末。

制备聚丙烯酰胺凝胶的具体方法是:将1ml酶溶液(酶溶于适当缓冲液中),加于含750mg丙烯酰胺单体和40mg N,N -甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中,再加入0.5ml 二甲氨基丙腈质量分数为5%的溶液作为加速剂,加入0.5ml过硫酸钾质量分数为1%的溶液作为引发剂。将此混合物在23℃下反应10min,便成为含酶的凝胶。凝胶的孔径为10～40~,将此固定化酶用于生化反应过程,底物和产物可通过凝胶格子进出,而酶分子则不能渗出。

3.2　辐射包埋法[2]

酶溶解在纯单体水溶液、单体加聚合物水溶液或纯聚合物溶液中,在常温或低温下,用C 射线、x射线或电子束进行辐射,可以得到包埋有酶的亲水凝胶。

3.3　卡拉胶包埋法[3]

卡拉胶(K-Carrageenan)是由角叉菜提取的一种多糖。具体包埋方法是将100mg酶在37～50℃下溶于1mL蒸馏水中,另将1.7g卡拉胶在40～60℃下溶于34mL生理盐水中,将上述两种溶液混合,然后冷却至10℃,使凝胶形成并强化。将凝胶浸在浓度为0.3mol/L的氯化钾溶液中硬化,将此硬化凝胶作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。如将此固定化酶再用硬化剂如单宁、戊二醛或六甲叉二胺处理,便可得到更稳定的固定化酶。此法条件温和,操作简单,可供多种酶固定化之用。

3.4　微囊法[4]

此法是将酶包埋于半透性聚合体膜内或包埋于液膜内,形成直径为1～100L m的微囊。微囊制备方法如下:

(1)界面聚合法。此法是将酶的水溶液和亲水单体用一种与水不混溶的有机溶剂作成乳化液。再将溶于同一有机溶剂的疏水单体溶液,在搅拌下,加入上述乳化液中。在乳化液中的水相和有机溶剂相之间的界面发生聚合作用形成半透膜,这样水相中的酶即被包埋于半透膜内。

(2)液体干燥法。将一种聚合物溶于一种沸点低于水且与水不混溶的溶剂中,加入酶的水溶液,以油溶性表面活性剂为乳化剂,制成第一种乳化液。把它分散于含有保护性胶质(如明胶)、聚丙烯醇和表面活性剂的水溶液中,形成第二种乳化液。在不断的搅拌、低温和真空条件下蒸出有机溶剂,便得到含酶的微囊。常用的聚合物为乙基纤维素、聚苯乙烯、氯化橡胶等,常用的有机溶剂为苯、环己烷和氯仿。

(3)分相法。将酶的水溶液分散于含有聚合物的与水不混溶的有机溶剂中,一边搅拌,一边加入另一种有机溶剂(它与前一种有机溶剂可混溶)。此时聚合物浓缩,在微小水滴的周围形成薄膜。

上述两种有机溶剂都必须与水不混溶。例如,聚合物为乙基纤维素时,第一种有机溶剂为四氯化碳,第二种为石油醚;聚合物为硝基纤维素时,第一种有机溶剂为乙醚,第二种为苯甲酸丁酯。

(4)液膜(脂质体)法。上述微囊法是用半透膜包埋酶液,近年又研究出采用液膜的新微囊法。例如,糖化酶的液膜固定化方法,是用由表面活性剂和卵磷脂制成的脂质体液膜来作微囊的。

此法的最大特征是,底物和产物穿过液膜