固定化酶制备方法研究进展_曹树祥
2.3酶固定化方法的研究进展
- 1 -酶固定化方法的研究进展1摘要：酶作为一种生物催化剂，对环境十分敏感，易受物理、化学和生物等因素的影响而失活，而且反应后混入产品，纯化困难，不能实现连续操作，这些难以克服的现象大大限制了酶促反应在工业中的应用，在这种条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展。
现如今，固定化酶技术已成为酶工程研究的重点和热点之一，该技术作为一种能有效提高生产效率的手段正引起人们的广泛重视.与游离酶相比，固定化酶有许多突出优点,尤其是稳定性和可重复使用性,使其在许多领域得到广泛应用。
本文介绍了固定化酶制备的常用方法（吸附法、包埋法、共价法、交联法）以及各种各样的载体材料,同时对酶在一些性能优良的载体上的固定进行了综述。
关键词：酶；固定化；载体中图分类号：TQ1．引言酶的化学本质是蛋白质，其催化作用具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点。
但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入催化产物，分离纯化困难，不能重复使用。
为了克服上述难题，在20 世纪60 年代发展起来了一项生物工程技术，叫固定化酶技术(Immobilized Enzyme)。
所谓的酶固定化是指用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术。
该技术克服了自由酶的上述不足，提高了酶的储存稳定性，实现了重复使用及连续自动化生产，降低了成本，在生物工程、食品工业、医药和精细化学工业等领域有着广泛的应用前景。
2．酶的固定化方法根据固定酶材料与酶分子之间结合力的不同，可分为化学法和物理法。
化学法又可分为交联法和共价结合法。
交联法需要双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键，从而把酶束缚在固体材料上。
共价结合法是通过酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团形成化学共价健实现不可逆结合的酶固定方法。
化学法所得的固定化酶与载体连接牢固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。
酶的固定化方法的研究进展
徐娟等（２００８）选择以Ｄ３８０大孔弱碱性丙烯酸系阴 离子交换树脂为载体，通过先吸附后交联的方法固定化 ｄ一淀粉酶。通过实验对影响固定化酶活力回收率的因素 的进行了研究，得出较优的固定化条件为：戊二醛浓度 ０．１％、处理时间４５ ｍｉｎ、加酶量３ ｍｇ／ｇ（蛋白量／载体）、 酶液在ｐＨ５．８、２５℃，固定化处理时间６～１０ ｈ的条件下， 获得的固定化酶活力可达８０ Ｕ／ｇ（载体），并进一步对固定 化酶的酶学性质作了初步研究罔。
王伟、杨开伦等（２００８）以壳聚糖为载体，戊二醛为交 联剂，用吸附交联法对氨基酰化酶进行了固定化。研究结 果表明，在ｐＨ值为６．０，温度３０℃的条件下，０．１ ｇ壳聚 糖微球与５ ｍＬ １％戊二醛交联后，固定０．８ ｍｇ氨基酰化 酶的固定化效果最佳。固定化酶的最适温度和ｐＨ值分 别为５０℃和７．０，而游离酶的最适温度为４０℃，最适ｐＨ 值为７．５，固定化酶在５０～７０℃都保持了较高的酶活力， 热稳定性远高于游离酶，固定化酶的Ｋｍ值为１１．７９６ｘ １０之ｍｏｌ／Ｌ，较游离酶有所升高，该固定化酶具有良好的操 作稳定性［１ｌ】。
２交联法
交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之 间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形 成共价键１９］。常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试 剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附 法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力， 又起到加固的效果。
兹性微球固定化酶工艺研究进展
Ｒｅ ｅ ｒ ｈ Ａｄ ａ ｃ ｆ ｍ ｍ ｏ ｉｉ ｅ ｚ ｍ ｅ ｓ ａ ｃ ｖ ｎ ｅｏ Ｉ ｂ ｌ ｄ Ｅｎ ｙ ｚ Ｐｒ ｐ ｒ ｔｏ ｃ ｏ ｏ ｙ ｂａ ｅ ｎ Ｍ ａ ｎｅ ｉ ｉ ｒ ｓ ｅ ｅ ｅ ａ ａ ｉ ｎ Ｔｅ ｈｎ ｌ ｇ ｓ ｄ ｏ ｇ ｔ Ｍ ｃ ｏ ｐｈ ｒ ｓ ｃ
性 质不 发 生变 换 。作 为 一种 生物 催 化剂 ，酶 可以 在常
温 常压 等 温和 条 件 下高 效地 催 化反应 ，一 些难 以 进行
定 化技 术 克 服 了游 离酶 的许 多缺 点 ，但是 固定化 酶 技 术 目前还 存 在 固定 效率 低 、载 体 的有 毒性 、成 本高 、 稳 定性 差 、不能 大规 模 生 产等 问 题 ，这 些都 限制 了固 定 化 酶技 术 的发 展 与应 用 。在 固 定化 酶技 术 中 ，载 体
材 料 的结 构和 性 能对 酶 的 活性 保持 及 应用 至 关重 要 ， 因此对 固定化 酶载 体的研 究成 为该 领域研 究的 热点 。
的 化学 反应 在酶 的催化 作 用下 也可 顺利 地 进 行 反 应 ， 而 且 反 应 底物 专 一 性 强 、副 反 应 少 等 优 点 大 大 促 进 了人 们 对 酶 的应 用 和 酶 技 术 的 研 究 ｔ ｃ ｏ ｐ ｅ ｅ ｉ ｔ ａ ｔ Ｍ ｇ ｅ ｉ ｍｉ ｒ ｓ ｈ ｒ ｍｍｏ ｉ ｚ ｄ ｅ ｚ ｍｅ ｉ ｉ ｄ ｏ ｃ ｂ ｌ ｅ ｎ ｙ ｓａｋ ｎ ｆｉ ｉ ｍｍｏ ｉ ｚ ｄ ｅ ｚ ｍｅ ｂ ｓ ｄ ｏ ｇ ｅ ｉ ｂ ｌ ｅ ｎ ｙ ａ ｅ ｎ ｍａ ｎ ｔ ｉ ｃ ｍ ｉｒ ｓ ｈ ｒ ｓ Ｉ ｅ ｅ ｔ ｅ ｒ ， ｅ ａ ｓ ｔｈ ｓｇ ｏ ｎ ｉｏ ｍｅ ｔ ｌｃ ａ ａ ｔ ｒｓ ｉ ｓ ｒ ｐ ａｅ ｓ ｆｅ ｔ ｎ ｃ ｏ ｐ ｅ ｅ ． ｎ ｒ ｃ ｎ ａ ｓ ｂ ｃ ｕ ｅ ｉ ａ ｏ ｄ ｅ ｖ ｒ ｎ ｎ ａ ｈ ｒ ｃ ｅ ｉ ｔ ， ｅ ｅ ｔ ｄ ｕ ｅ ｅ ｆ ｃ ，ａ ｄ ｙ ｃ ｉ ｃ ｎ ｒ ｄ ｃ ｈ ｒ ｄ ｃ ｉ ｎ Ｃ Ｓ， ｈ ｓ ｅ ｚ ｍｅ ｈ ｓ ｂ ｃ ｍ ｅ ｔ ｅ ｆ ｃ ｓｏ ｅ ｅ ｃ ．Ｔ ｅ ｒ ｓ ａ ｃ ｄ ａ ｃ ｆ ｔ ａ ｅ ｕ ｅ ｔ ｅ ｐ ｏ ｕ ｔ Ｏ ｔ ｔ ｉ ｎ ｙ ａ ｅ ｏ ｈ ｏ ｕ ｆｒ ｓ ａ ｈ ｈ ｅ ｅ ｒ ｈ ａ ｖ ｎ ｅ ｏ ｏ ｒ ｍａ ｎ ｔ ｉ ｒ ｓ ｈ ｒ ｍｍ ｏ ｉｉｅ ｎ ｙ ｅ ｐ ｅ ａ ａ ｉ ｎ ｔ ｃ ｎ ｌ ｇ ， ｈ ｐ ｌ ａ ｉ ｎ ａ ｄ ｔ ｅ ｄ ｖ ｌ ｐ ｅ ｔ ｇ ｅｉ ｍ ｃ ｏ ｐ ｅｅｉ ｃ ｂ ｌ ｄ ｅ ｚ ｍ ｒ ｐ ｒ ｔｏ ｅ ｈ ｏ ｏ ｙ ｔ ｅ ａ ｐ ｉ ｔｏ ｎ ｈ ｅ ｅ ｏ ｍ ｎ ｚ ｃ ｐ ｏ ｐ ｃ ｆｍａ ｎ ｔ ｉ ｒ ｓ ｈ ｒ ｒ ｓ ｅ ｔ ｇ ｅｉ ｍ ｃ ｏ ｐ ｅ ｅｉ ｏ ｃ ｍｍｏ ｉ ｚ ｄ ｅ ｚ ｍｅ ｗａ ｉ ｌ ｎ ｒ ｄ ｃ ｄ ｉ ｉ ａ ｅ ． ｂ ｌ ｅ ｎ ｙ ｓｍａ ｎ ｙ ｉ ｔ ｕ ｅ ｔ ｓ ｐ ｒ ｉ ｏ ｎ ｈ ｐ Ｋ ｅ ｒ ： ｇ ｅｉ ｃ ｏ ｐ ｅ ｅ ； ｍ ｍｏ ｉ ｚ ｄ ｅ ｚ ｍ ｅ ｐ ｅ ａ ａｉ ｎ ｔ ｃ ｎ ｌ ｇ ｙ ｗｏ ｄｓ ｍａ ｎ ｔ ｍｉ ｒ ｓ ｈ ｒ ｓ ｉ ｃ ｂ ｌ ｅ ｎ ｙ ； ｒ ｐ ｒｔ ｈ ｏ ｏ ｙ ｉ ｏ ｅ
固定化酶制备方法研究进展
专论与综述 固定化酶制备方法研究进展曹树祥 黎苇(九江职业大学,九江332000)摘要 对固定化酶的主要制备方法进行了系统的阐述,根据作者本人的试验经验对目前应用和研究得较多的方法作了详细的说明,对所阐述的各种固定化酶的制备方法的优缺点进行了比较。
关键词 固定化酶 吸附 包埋 共价键结合 肽键结合 交联 本世纪60年代,一项新的技术——固定化酶技术开始发展起来。
最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来,成为不溶于水的酶的衍生物,称为“水不溶酶”或“固相酶”。
后来发现,也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中。
将酶置于超滤装置中时,高分子底物与酶被截留在超滤膜一侧,而反应物可以透过膜流出,在这种情况下,酶本身仍是可溶的,只不过被固定在一个很有限的空间内,因此用水不溶酶和固相酶的名称不恰当。
1997年第1届国际酶工程会议正式建议采用“固定化酶”的名称。
从60年代起,固定化酶的研究迅速发展,固定化方法目前已超过200种以上。
近来研究较多且应用最广的两种方法分别为卡拉胶聚糖包埋法和海藻酸钙凝胶包埋法。
本文依据国内外有关文献及作者在这一领域的试验与体会就固定化酶的主要制备方法作简要介绍与评述。
1 固定化酶制备方法的分类固定化酶的制备方法可分为如下几类:(1)吸附法:物理吸附法、离子吸附法等。
(2)包埋法:聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法和微囊法等。
(3)共价键结合法:重氮化法、烷基化和芳基化法、戊二醛处理法、钛螯合法、硫醇-二硫化物互换反应法和四组分缩合反应法等。
(4)肽键结合法:酰基迭氮衍生物法、溴化氰活化的多糖法、碳酸纤维素衍生物法、马来酐衍生物法、异氰衍生物法和硫酰胺结合法等。
(5)交联法。
2 吸附法2.1 物理吸附法[1]使酶直接吸附在载体上的方法称为物理吸附法。
常用的载体有:(1)有机载体,如面筋、淀粉等;(2)无机载体,如氧化铝、活性炭、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛等。
固定化酶的研究进展
固定化酶的研究进展
固定化酶以其优越的特性，在物理化学过程中发挥着重要的作用。
近年来，固定化酶的研究已取得了重大突破，为解决各种化学反应问题提供了新的思路和解决方案。
1．固定化酶的研究历史
固定化酶的研究可以追溯到1899年，当时海尔士和罗斯证明可以将酶结合到珠粒或陶瓷体中。
之后，1904年，韦伯提出了将酶固定在改性双氧水Gel上的概念，这标志着固定化酶研究正式开始。
在后续几年中，研究人员们利用不同类型的支撑体，研究固定化酶的活性及固定方法，例如改性的石英粉和橡胶等。
1960年代，随着计算机和分子生物学的发展，人们对固定化酶的了解加深了，同时，也解决了以往无法实现的合成反应问题，这大大促进了细胞工程技术的发展。
这一时期的固定化酶研究主要集中在对酶结构和活性的研究，以及利用多种体内诱导因子来实现酶固定化的方法，例如培养基、氯仿等。
2．固定化酶的进展
随着生物技术的发展，固定化酶的应用可以说是前所未有的。
今天，科学家们可以利用先进的技术，将多种酶和酶-活性物质结合在一起，形成不同功能的复合酶体，以提高它们的反应活性。
近年来，固定化酶的研究重点也在拓展。
固定化酶制备及应用的研究进展
固定化酶制备及应用的研究进展
摘要
固定化酶是一种将酶固定到支持材料上的一种技术，广泛应用于有机合成、蛋白质工程、药物分析、生物电化学、环境污染检测等领域。
近年来，固定化酶的研究受到了广泛关注，技术的不断发展改变了传统的固定化酶方法，这产生了重要的应用价值。
本文对最新的固定化酶制备和应用的研究进展进行综述，包括固定化酶的支持材料、固定化技术、活性测定以及固定化酶的应用。
随着新型支持材料和合成技术的不断发展，未来固定化酶将具有广泛的应用和巨大的市场前景。
关键词：固定化酶；支持材料；固定化技术；活性测定
1引言
随着现代科技的发展，生物催化剂的耐受性和可用性都得到了大幅提高，而且易于储存和运输。
这使得固定化酶变得更加重要，越来越受到学者的重视。
固定化酶可以有效改善组装酶的活性、稳定性和可控性，并可以在传统的酶反应技术中取得良好的效果，从而实现生物催化剂的多种多样的应用[1]。
2固定化酶的支持材料
固定化酶的支持材料一般分为生物支持材料和无机支持材料，两者有着不同的优缺点，在实际应用中，应实现有机无机材料的有机结合，才能获得良好的固定化效果。
酶固定化技术的研究和进展
固定化酶技术是２０世纪６０年代发展起来的一项生物工程技术，是使生物酶得到广泛而有效利用的重要手段．酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术．与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现储存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点．固定化酶的研究不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且具有节省能源与资源、减少污染的生成．1固定化酶的概念它是不溶于水的酶．是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的．酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用．便于运输和贮存，有利于自动化生产．固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景．2固定化酶的制备方法２．１物理法物理方法包括物理吸附法、包埋法等．物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留．但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，因此对一些反应不适用．２．２化学法化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来，而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法．3固定化酶和游离酶的比较与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点．固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃，得到迅速发展和广泛的应用，而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求．目前，固定化技术已经取得了许多重要成果，充分发挥了固定化酶和固定化细胞在改革工艺和降低成本方面的巨大潜力．但从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，但已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种．4酶的固定化方法传统方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法等．吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法．见图１．４．１吸附法吸附法（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法．酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等．吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法．４．１．１物理吸附法是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法．是制酶固定化技术的研究和进展郑善切（泉州师范学院，福建泉州366200）摘要：酶是一种生物催化剂，广泛用于食品加工、医药和精细化工等行业.而酶自身的缺点如稳定性差，不能重复使用而难以广泛的在工业中应用.因此，人们开始对酶的特性进行研究，通过模仿人体膜的作用机理，利用固定化技术对其加以固定改造，克服它的固有缺陷.21世纪，酶固定化技术的发展因其诸多优点，正得到全面深入的研究.关键词：酶；固定化技术；载体中图分类号：Ｑ８１４文献标识码：A文章编号：1673-260X （2011）02-0036-03Vol.27No.2Feb.2011第27卷第2期2011年2月赤峰学院学报（自然科学版）Journal of Chifeng University （Natural Science Edition ）３６－－备固定化酶最早采用的方法，如α－淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此法进行固定化．物理吸附法常用的有机载体如纤维素、胶原、淀粉及面筋等；无机载体如活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等．４．１．２离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法．此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β－淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广．如最早应用于工业化生产的氨基酰化酶，就是使用多糖类阴离子交换剂二乙基氨基乙基（ＤＥＡＥ）－葡聚糖凝胶固定化的．此外，ＤＥＡＥ－纤维素吸附的α－淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶．４．２包埋法是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法．前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型．４．２．１凝胶包埋法凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂．４．２．２微胶囊包埋法微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法．它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性．常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等．４．３共价键结合法是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法．酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：（１）酶蛋白Ｎ末端的α－氨基或赖氨酸残基的ε－氨基．（２）酶蛋白Ｃ末端的α－羧基、天门冬氨酸残基的β－羧基以及谷氨酸残基的γ－羧基．（３）半胱氨酸残基的巯基．（４）丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基．（５）组氨酸残基的咪唑基．（６）色氨酸残基的吲哚基．（７）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环．４．３．１重氮法重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种．常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等．４．３．２叠氮法即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶．含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化．如ＣＭＣ、ＣＭ－ｓｅｐｈａｄｅｘ（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯－顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶，其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法．４．３．３溴化氰法即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶．任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化．由于该法可在非常缓和的条件下与酶蛋白的氨基发生反应，近年来已成为普遍使用的固定化方法．尤其是溴化氰活化的琼脂糖已在实验室广泛用于固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂．４．３．４烷化法和芳基化法以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、苯酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化．此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物．４．４交联法是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法．由于酶蛋白的功能团，如氨基、咪唑基，参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显．但是尽可能地降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高．以上四种固定化酶方法各有其优缺点（见表１）．往往一种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶．在实际应用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短．5新型酶固定化方法及应用开发新型酶固定化方法的原则是：实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，尽量减少或避免酶活力的损失．通过辐射、光、等离子体、电子等新方法均可制备高活性固定化酶．Ｍｏｈｙ等［６］以１３７Ｃｓ为３７－－辐射源，通过γ－射线引发将甲基丙烯酸甲酯接枝共聚于尼龙膜表面，经进一步活化，用于青霉素酰化酶的固定．光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶．Ｌｉ等［７］利用含芳香叠氮基的光活性酯，在远紫外光辐照下，叠氮基光解生成氮烯与ＰＥＳ膜表面的Ｃ－Ｈ键间发生插入反应形成仲胺，将脲酶共价键合到ＰＥＳ膜的表面．等离子体是高度激发的原子、分子、离子以及自由基的聚集体，大量的等体进行有用修饰，从而引入活性基团．Ｐｕｌｅｏ等将钛合金Ｔｉ－６Ａｌ－４Ｖ表面用丙烯酸氨等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化．离子体常在室温下存在．载体材料表面可以由等离子新应用：１．微胶囊化尼龙珠．２．丙烯酰胺包埋，已经运用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ），也应用于酶的包埋．３．酶在非孔玻璃表面的共价固定化，缺点是玻璃对强酸和溶剂油抵抗能力，并且它具有紧密的固体结构，因此在技术过程方面成为了酶固定化的有价值材料．而玻璃的惰性和较小的可接受面，因此必须在固定化之前硅烷化．４．可调孔玻璃的固定化，它有多微孔结构，是一种特殊的有较大表面的烧结玻璃，现已经被用于直接的酶固定化的活化型．５．共价固定化酶到聚酰胺，合成的聚合物在不同的技术应用中可用作酶固定化的基质．经常使用聚酰胺、聚酯、聚乙烯和聚乙烯乙醇．６．用三乙基氧化四氟硼酸的烷基化，蛋白质通过氨基键中氧的烷化固定到聚合物上．７．聚酰胺部分水解后固定化酶到氨基．８．聚酰胺部分水解后固定化酶到羧基．９．固定化酶到聚酯．１０．用碱水解和氯甲苯活化的固定化，用这种方法使脂键通过碱的处理被部分水解．１１．碱水解和由而吲哚碳酰的活化．与氯化物相比这个方法更有效和温和．6结束语目前，酶固定化技术已经普遍的在制药、食品生产、精细化的化工等等，特别在手性化合物行业得到应用，更是在环境污水处理方面大有可为．酶技术生产无“三废”产生，没有危险性，人们因环保的重视而更重视酶技术应用．如今，怎样更好利用天然的高分子，进行膜技术，纳米技术等来固定酶，将迎来一个高潮．而随着科学技术不断创新，各种新型的，更先进的固定化酶技术，还有固定化酶反应器的不断改进，将是个全新的课题．———————————————————参考文献：〔1〕陈建龙,祁建城,曹仪植,郭勇,段惠丽.固定化酶研究进展[J].化学与生物工程,2006．〔2〕肖海军,贺筱蓉.固定化酶及其应用研究进展[J].生物学通报,2001(07,02)．〔3〕固定化酶与固定化细胞[J].辽宁大学学报(自然科学版),1982(S1)．〔4〕马晓建,白净,任珂,邱竹.酶工程研究的新进展[J].化工进展,2003(08)．〔5〕刘建龙,王瑞明,刘建军,杨连生.酶的固定化技术研究进展[J].中国酿造,2005(09)．〔6〕宋丽,宋宝东,蒋亚庆.酶的固定化及在生物传感器的应用[J].化学与生物工程,2006(11)．〔7〕黎刚.固定化技术进展[J].中国生物工程杂志, 2002(05)．〔8〕杨玉玲.酶固定化技术及载体材料研究新进展[J].粮油食品科技,2001(05)．〔9〕钱军民,张兴,吕飞,李旭祥.酶固定化载体材料研究新进展[J].化工新型材料,2002(10)．〔10〕李晓燕,董志贤.酶工程及其新进展[J].甘肃农业,2004(09)．〔11〕吴显荣.酶工程的研究及其应用[J].世界农业, 1995(01)．吸附法包埋法共价键结合法交联法物理吸附法离子吸附法制备易易较难难较难结合程度弱中等强强强活力回收率高，但酶易流失高高低中等再生可能可能不可能不可能不可能固定化成本低低低高中等底物专一性不变不变不变可变可变表１各种固定化方法的比较３８－－。
固定化酶制备及应用的研究进展.
固定化酶制备及应用的研究进展摘要：本文主要从分析酶单独应用中的不足、酶的固定化载体、固定化方法等方面介绍了固定化酶制备中的研究进展情况，并且从医药、食品、环保、化学工业、能源等方面其在其中的新应用出发，对固定化酶在新领域中的应用作了综述，给固定化酶研究的发展前景进行了展望，并且指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶的固定化及制备高活性、高负载、高稳定性的固定化酶。
关键字：酶；酶的固定化；载体；酶固定化应用领域酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。
但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。
1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。
固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。
本文将从酶生物催化剂固定化载体、固定化方法和技术及固定化酶的应用等几个方面出发，归纳和综述这些方面近年来的研究进展。
1酶固定化的传统方法关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。
1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。
显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。
但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。
固定化酶的研究进展
固定化酶的研究进展固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。
最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。
但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。
在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。
因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。
在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。
一固定化酶的发展历程[1]酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。
作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。
近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。
1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。
我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作二固定化酶的特点[2] [3]固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。
固定化酶制备α-环糊精和固定化细胞催化合成CTP的开题报告
固定化酶制备α-环糊精和固定化细胞催化合成CTP的开题报告一、研究背景α-环糊精是一种自然产物，可以形成包合物来改善某些化合物的性质和特征。
α-环糊精广泛应用于药品、医学和化妆品等领域。
目前，α-环糊精的制备方法包括化学合成和微生物发酵。
然而，这些方法具有成本高和产量低的缺点。
固定化酶的制备过程简单，运营成本低，因此被广泛应用于酶催化反应。
细胞催化合成CTP是利用无细胞膜的果糖、羧化酶和ADP的高亲和性合成成CTP。
该反应是一个重要的有机合成方法，可以应用于药物、农药和颜料等领域。
固定化细胞催化合成CTP的研究可以提高反应速率和产率，减少废弃物和增加反应的重复性。
因此，本研究旨在通过固定化酶和固定化细胞的方法制备α-环糊精和催化合成CTP，以提高产量和降低成本。
二、研究方法1. 固定化酶准备方法α-环糊精酶是一种特定的酶，可以催化α-环糊精的形成。
本研究将α-环糊精酶固定在含有聚酰胺基团的材料上。
首先，将α-环糊精酶与聚酰胺复合物混合，然后将复合物洗涤和干燥。
最终，固定化酶被制备成为颗粒状物料。
2. 固定化细胞制备方法本研究使用果糖和ADP作为底物，使用羧化酶进行酰基化，将三磷酸胸腺嘧啶（CTP）合成。
为了提高产量和反应速率，将细胞固定于载体上。
将细胞和载体混合，将混合物过滤和洗涤，然后将固定化细胞干燥得到。
三、研究意义本研究将固定化酶和固定化细胞应用于α-环糊精制备和合成CTP的反应中，可以提高产量和降低成本，从而在药品、化妆品和农药等领域有潜在的应用前景。
此外，本研究对于开发更多的固定化催化剂也具有一定的参考和指导作用。
四、研究计划1. 制备和固定化α-环糊精酶。
2. 针对CTP合成反应优化固定化细胞的制备和反应条件。
3. 评估固定化酶和固定化细胞催化生产CTP的效率和产率的差异。
4. 探究固定化酶和固定化细胞与自由酶和细胞的优缺点。
5. 验证固定化酶和固定化细胞在工业生产中的可行性。
五、预期成果本研究预计能够成功地制备α-环糊精和催化合成CTP的固定化酶和固定化细胞。
固定化酶的研究进展及其在食品工业中的应用
分 为凝胶 包埋 法 和 半透 膜 包埋 法 （ 也称 微 胶
囊包 埋 法 ） 。凝胶 包埋 法采 用天 然凝 胶 和合 成 凝
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ６— ０ ３— ２ ７
基金项 目： 国家 自然科学基金 （ ３ １ ３ ７ １ ８ ３ ９ ） ； 山东省高校科学与技术发展规划 （ Ｊ １ ３ Ｌ Ｅ ０ ２ ） 作者简介 ： 侯瑾 （ １ ９ ９ ２ 一） ， 女， 齐鲁 工业 大学食品科学与工程学 院在读硕士研究 生 ；
李迎秋 （ １ ９ ７ ２ 一） ， 女， 齐鲁工 业大学食品科学与工程学院教授 ， 博士 。
一
９ 一
胶 。包 埋 法 是 目前 细 胞 固定 化 研 究 和 应 用 最 普 遍
的方 法 。
３ 固定 化 酶 在 食 品工 业 中的 应 用
３ ． １ 在 淀粉 转化 中的应用 淀粉容 易变性 ， 可满 足不 同酶 固定 化 的需 要 ， 是
使用 ， 降低 成 本 ； 催化反应更容易控制 ； 在 多 酶 系统
的协 同作 用 下 ， 可以大大提 高酶催化反应 的速度 ；
具 有减 少 污染 的生 态 性 吸 附 材 料 。离 子 吸 附 法 主要 是利 用 含 有 离 子 交 换 基 团 的 不 溶 性 物 质来 吸 附， 常用 的载 体有 阴离 子 和 阳离子 交 换 剂 。 吸附 法 工艺 比较 简 单 ， 条 件 比较 温 和 ； 酶 的催 化 活力 损 失 少， 酶 的构 象 很 少 或 基 本 不 变 。 采 用 吸 附 法 ， 可 利
中 的应 用 ， 这 是 酶 应 用 史 上 的一 次 重 大 变 革。
用 的载体 多 、 价格 较 低 ； 制 备 的酶分 子 水 平 高 ， 不 易
固定化酶制备方法研究进展
固定化酶制备方法研究进展
曹树祥;黎苇
【期刊名称】《化工环保》
【年(卷),期】1999(019)005
【摘要】对固定化酶的主要制备方法进行了系统的阐述,根据作者本人的试验经验对目前应用和研究得较多的方法作了详细的说明,对所阐述的各种固定化酶的制备方法的优缺点进行了比较.
【总页数】5页(P273-277)
【作者】曹树祥;黎苇
【作者单位】九江职业大学,九江,332000;九江职业大学,九江,332000
【正文语种】中文
【中图分类】TQ42
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固定化酶技术进展 ？固定化方法？
固定化酶技术进展？固定化方法？
张立武;徐僖
【期刊名称】《成都科技大学学报》
【年(卷),期】1989(000)005
【摘要】本文着重评述了固定化酶技术体系的核心——酶的固定化方法的原理、特点和应用,提出了一种通过声(力)化学反应固定酶的新方法。
【总页数】7页(P109-114,126)
【作者】张立武;徐僖
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】TQ426.97
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专论与综述 固定化酶制备方法研究进展曹树祥 黎苇(九江职业大学,九江332000)摘要 对固定化酶的主要制备方法进行了系统的阐述,根据作者本人的试验经验对目前应用和研究得较多的方法作了详细的说明,对所阐述的各种固定化酶的制备方法的优缺点进行了比较。
关键词 固定化酶 吸附 包埋 共价键结合 肽键结合 交联 本世纪60年代,一项新的技术——固定化酶技术开始发展起来。
最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来,成为不溶于水的酶的衍生物,称为“水不溶酶”或“固相酶”。
后来发现,也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中。
将酶置于超滤装置中时,高分子底物与酶被截留在超滤膜一侧,而反应物可以透过膜流出,在这种情况下,酶本身仍是可溶的,只不过被固定在一个很有限的空间内,因此用水不溶酶和固相酶的名称不恰当。
1997年第1届国际酶工程会议正式建议采用“固定化酶”的名称。
从60年代起,固定化酶的研究迅速发展,固定化方法目前已超过200种以上。
近来研究较多且应用最广的两种方法分别为卡拉胶聚糖包埋法和海藻酸钙凝胶包埋法。
本文依据国内外有关文献及作者在这一领域的试验与体会就固定化酶的主要制备方法作简要介绍与评述。
1 固定化酶制备方法的分类固定化酶的制备方法可分为如下几类:(1)吸附法:物理吸附法、离子吸附法等。
(2)包埋法:聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法和微囊法等。
(3)共价键结合法:重氮化法、烷基化和芳基化法、戊二醛处理法、钛螯合法、硫醇-二硫化物互换反应法和四组分缩合反应法等。
(4)肽键结合法:酰基迭氮衍生物法、溴化氰活化的多糖法、碳酸纤维素衍生物法、马来酐衍生物法、异氰衍生物法和硫酰胺结合法等。
(5)交联法。
2 吸附法2.1 物理吸附法[1]使酶直接吸附在载体上的方法称为物理吸附法。
常用的载体有:(1)有机载体,如面筋、淀粉等;(2)无机载体,如氧化铝、活性炭、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛等。
用此法制成的固定化酶,活力损失少,但酶与载体的结合不牢固,易于脱落,很少有实用价值。
2.2 离子吸附法[1]此法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体结合,酶吸附于载体上较为牢固。
此法在工业上应用较广泛,常用的载体有:(1)阴离子交换剂,如二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类(ECTEOLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、IRA-410、IRA-900等;(2)阳离子交换剂,如羧甲基(CM)-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-120、IR-200、Dowex-50等。
1999-01-12收到初稿,1999-05-30收到修改稿。
3 包埋法包埋法是将酶包埋于凝胶或其他聚合体格子内,这种结构可以防止酶渗出,但是底物能渗入格子内与酶相接触。
此法的优点是适用范围广,许多种酶都可用此法固定,工艺简便,酶分子仅仅是被包埋起来,固定化过程中酶未参与化学反应,故可得到活力较高的固定化酶。
但是,用此法制成的固定化酶,不能对大分子底物的生化反应起催化作用。
3.1 聚丙烯酰胺凝胶包埋法此法是将含有游离酶的水溶液与丙烯酰胺溶液混合,在交联剂、引发剂等的作用下,丙烯酰胺聚合成凝胶,将酶包埋入凝胶格子,将所得凝胶作成颗粒,低温贮存或冷冻干燥成为粉末。
制备聚丙烯酰胺凝胶的具体方法是:将1ml酶溶液(酶溶于适当缓冲液中),加于含750mg丙烯酰胺单体和40mg N,N -甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中,再加入0.5ml 二甲氨基丙腈质量分数为5%的溶液作为加速剂,加入0.5ml过硫酸钾质量分数为1%的溶液作为引发剂。
将此混合物在23℃下反应10min,便成为含酶的凝胶。
凝胶的孔径为10～40~,将此固定化酶用于生化反应过程,底物和产物可通过凝胶格子进出,而酶分子则不能渗出。
3.2 辐射包埋法[2]酶溶解在纯单体水溶液、单体加聚合物水溶液或纯聚合物溶液中,在常温或低温下,用C 射线、x射线或电子束进行辐射,可以得到包埋有酶的亲水凝胶。
3.3 卡拉胶包埋法[3]卡拉胶(K-Carrageenan)是由角叉菜提取的一种多糖。
具体包埋方法是将100mg酶在37～50℃下溶于1mL蒸馏水中,另将1.7g卡拉胶在40～60℃下溶于34mL生理盐水中,将上述两种溶液混合,然后冷却至10℃,使凝胶形成并强化。
将凝胶浸在浓度为0.3mol/L的氯化钾溶液中硬化,将此硬化凝胶作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。
如将此固定化酶再用硬化剂如单宁、戊二醛或六甲叉二胺处理,便可得到更稳定的固定化酶。
此法条件温和,操作简单,可供多种酶固定化之用。
3.4 微囊法[4]此法是将酶包埋于半透性聚合体膜内或包埋于液膜内,形成直径为1～100L m的微囊。
微囊制备方法如下:(1)界面聚合法。
此法是将酶的水溶液和亲水单体用一种与水不混溶的有机溶剂作成乳化液。
再将溶于同一有机溶剂的疏水单体溶液,在搅拌下,加入上述乳化液中。
在乳化液中的水相和有机溶剂相之间的界面发生聚合作用形成半透膜,这样水相中的酶即被包埋于半透膜内。
(2)液体干燥法。
将一种聚合物溶于一种沸点低于水且与水不混溶的溶剂中,加入酶的水溶液,以油溶性表面活性剂为乳化剂,制成第一种乳化液。
把它分散于含有保护性胶质(如明胶)、聚丙烯醇和表面活性剂的水溶液中,形成第二种乳化液。
在不断的搅拌、低温和真空条件下蒸出有机溶剂,便得到含酶的微囊。
常用的聚合物为乙基纤维素、聚苯乙烯、氯化橡胶等,常用的有机溶剂为苯、环己烷和氯仿。
(3)分相法。
将酶的水溶液分散于含有聚合物的与水不混溶的有机溶剂中,一边搅拌,一边加入另一种有机溶剂(它与前一种有机溶剂可混溶)。
此时聚合物浓缩,在微小水滴的周围形成薄膜。
上述两种有机溶剂都必须与水不混溶。
例如,聚合物为乙基纤维素时,第一种有机溶剂为四氯化碳,第二种为石油醚;聚合物为硝基纤维素时,第一种有机溶剂为乙醚,第二种为苯甲酸丁酯。
(4)液膜(脂质体)法。
上述微囊法是用半透膜包埋酶液,近年又研究出采用液膜的新微囊法。
例如,糖化酶的液膜固定化方法,是用由表面活性剂和卵磷脂制成的脂质体液膜来作微囊的。
此法的最大特征是,底物和产物穿过液膜时与膜的孔径无关,但与底物和产物在膜组分中的溶解度有关。
3.5 辅因子微囊法辅因子如与大分子以共价键结合,是不能留在聚酰胺膜微囊的。
Yu等[5]使用新的拟脂-聚酰胺膜微囊,使辅因子可以保持原样地留在微囊内。
此法可以制备固定化脲酶、谷氨酸脱氢酶、醇脱氢酶等。
4 共价键结合法共价键结合法是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法,此法研究较为深入。
与载体以共价键结合的酶的功能团,包括:(1)氨基:赖氨酸的E-氨基和多肽键的N末端的A-NH2基;(2)羧基:天门冬氨酸的B-羧基、谷氨酸的A-羧基和末端A-羧基;(3)酚基:酪氨酸的酚环;(4)巯基:半脱氨酸的巯基;(5)羟基:丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基;(6)咪唑基:组氨酸的咪唑基;(7)吲哚基:色氨酸的吲哚基。
最常见的为氨基、羧基、酪氨酸和组氨酸的芳环。
此法的优点是,酶与载体的结合较为牢固,酶不易脱落,但因反应条件较为剧烈,酶活性有所降低,且制备过程较繁琐。
共价键结合法有以下几种:(1)重氮化法[6]。
此法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮化物通过共价键相连接而固定化。
含有氨基的载体先与亚硝酸反应生成重氮化合物,再与酶蛋白反应,使酶固定化。
常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺等。
(2)烷基化和芳基化法[4]。
以卤素为功能团的载体与酶蛋白的氨基与巯基发生烷基化或芳基化反应而成固定化酶。
此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。
卤乙酰衍生物包括氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维素、碘乙酰纤维素等。
(3)戊二醛处理法。
戊二醛与含有伯氨基的聚合物反应,可以生成具有醛功能的板模。
酶蛋白可与用戊二醛处理过的聚合物发生不可逆的结合,例如使用氨基乙基纤维素和戊二醛,可使胰蛋白酶等固定化[7]。
所用载体除氨基乙基纤维素外,也可用DEAE-纤维素、琼脂糖的氨基衍生物、部分脱乙酰壳质、氨基乙基聚丙烯酰胺、多孔玻璃的氨基硅烷衍生物等。
此外,还可将酶用物理吸附法吸附于多孔物质上,或用离子吸附法使酶与用聚乙烯亚胺处理的二氧化硅相结合后,再用戊二醛处理,使其成为固定化酶[8]。
(4)钛螯合法[9]。
Spheron是一种由羟乙基异丁烯酸酯和乙烯二异丁烯酸酯共聚而成的大孔亲水凝胶,带有很多羟基,可用钛螯合法供酶的固定。
钛盐无毒、无致癌性,价格低廉,且载体可以回收。
具体方法请参照文献[1]。
(5)硫醇-二硫化物互换反应法[10]。
聚合的二硫化物混合物可进行硫醇-二硫化物互换反应,产物可以与酶蛋白中的巯基进行可逆的偶联反应,并且只有巯基才能与之偶联,从而将酶蛋白固定在硫醇-二硫化物互换反应的产物——硫醇聚合物中。
(6)四组分缩合反应法[11]。
羧酸、亚胺、醛和异氰酸四组分的缩合反应可生成一种N-取代的酰胺。
选择适当的载体加入N-取代的酰胺,可使酶蛋白中的氨基和羧基直接相互偶联而固定化。
此法适用于固定对醛不敏感的酶。
5 肽键结合法这是在酶蛋白与水不溶性载体间形成肽键而被固定的方法。
此类方法包括以下几种。
5.1 用酰基迭氮衍生物固定化(1)将CM-纤维素酶转变为甲酯,再与肼作用,成为酰肼,此酰肼与亚硝酸作用成为相应的迭氮衍生物。
此衍生物在低温下与酶蛋白作用,使酶固定化[12]。
(2)聚甲基谷氨酸通过迭氮反应成为酰基迭氮衍生物,可用作脲酶和尿酸酶的载体制成固定化酶。
这些固定化酶可做成薄膜、球状、条状等,酶的活性可保留95%以上,且热稳定性高。
5.2 用溴化氰活化的多糖类固定化此法是将水不溶性多糖类、纤维素、交联右旋糖酐和琼脂糖用溴化氰活化后,供制备固定化酶用。
5.3 用碳酸纤维素衍生物固定化将纤维素粉悬浮于甲硫砜、二口恶烷和三乙胺混合溶剂中,并在0℃下加入氯甲酸酯,搅拌10min后,将反应液用浓盐酸中和,并移至乙醇中,制得活化纤维素。
将此活化纤维素加入溶有酶的中性缓冲液中,在5℃下缓缓搅拌4h,即得固定化酶。
5.4 用马来酐衍生物固定化马来酐与乙烯、苯乙烯等的共聚物可用于酶的固定化,例如,马来酐和乙烯共聚物在六甲叉二胺存在下与酶作用,则在马来酐与酶蛋白的氨基之间形成钛键,而得到固定化酶。
5.5 用异氰酸衍生物固定化将含有一个芳族氨基的载体在碱性条件下与光气反应,或将含有酰基迭氮衍生物的载体在加热下与盐酸反应,均可得到相应的异氰酸衍生物,所得异氰酸衍生物可供酶固定化用。
5.6 与硫酰胺结合固定化此法是使酶蛋白与载体的异硫氰酸衍生物之间形成硫酰胺键,再与酶反应而得到固定化酶。